斑蝥酸鈉維生素B6注射液對(duì)腫瘤患者外周血T淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子表達(dá)的影響.pdf

1、目的：根據(jù)中醫(yī)辨證理論，癌癥患者往往多種發(fā)病機(jī)制并存，故治療上也是多種治療方法并用。目前的研究成果表明，中藥主要通過(guò)以下幾個(gè)方面發(fā)揮臨床功效：調(diào)節(jié)免疫功能，抑制腫瘤新生血管的生成，誘導(dǎo)細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，直接殺傷腫瘤細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥，抗突變作用，抗腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。中藥抗腫瘤是多方向、多途徑發(fā)揮作用的，在臨床中應(yīng)堅(jiān)持辨證論治與辨病論治相結(jié)合。 斑蝥為芫菁科昆蟲(chóng)南方大斑蝥或黃黑小斑蝥的干燥全蟲(chóng)，現(xiàn)代藥學(xué)研究表明其主要

2、藥用成分是斑蝥素。斑蝥酸鈉是斑蝥素經(jīng)過(guò)氫氧化鈉水解生成的，其與維生素B6組成的復(fù)方制劑斑蝥酸鈉維生素B6注射液在保留斑蝥素抗癌作用的同時(shí)，其抗癌譜更廣，毒副作用更小。斑蝥酸鈉維生素B6注射液治療惡性腫瘤在臨床上已得到廣泛應(yīng)用，過(guò)去的研究表明其抗癌機(jī)制主要是細(xì)胞毒作用，對(duì)于其它作用機(jī)制的研究，如通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能抗腫瘤的研究也只是局限于臨床研究。而對(duì)于其抑制腫瘤新生血管的生成、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥、抗突變作用、

3、抗腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等機(jī)制的研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。 本研究首次通過(guò)體外試驗(yàn)，應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、放射免疫、RT-PCR等多種方法，試圖從細(xì)胞、分子和基因水平研究斑蝥酸鈉維生素B6注射液對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖和分泌IL-2、IL-4和趨化因子IL-8的影響，以進(jìn)一步探討斑蝥酸鈉維生素B6注射液的免疫調(diào)節(jié)作用和抑制腫瘤新生血管生成的作用，為斑蝥酸鈉維生素B6注射液的進(jìn)一步研發(fā)和臨床應(yīng)用提供更加可靠的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：

4、 1、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離：抽取惡性腫瘤患者靜脈血，采用：Ficoll密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞即淋巴細(xì)胞。 2、MTT法測(cè)定植物血球凝集素(Fhvtohomaggiutinin，PHA)誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)：將上述制備好的細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板，設(shè)空白對(duì)照組、PHA對(duì)照組和7個(gè)不同藥物濃度的實(shí)驗(yàn)組，T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后倒置顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化，用酶標(biāo)儀測(cè)OD值。選兩個(gè)促增殖作用最明顯的藥物濃度組為實(shí)驗(yàn)組并設(shè)．

5、PHA對(duì)照組進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。 3、流式細(xì)胞儀測(cè)定T淋巴細(xì)胞周期：細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。 4、放射免疫法測(cè)定IL-4和IL-8的含量：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后留取上清液，用IL-4和IL-8放免藥盒檢測(cè)其含量。 5、RT-PCR測(cè)定T淋巴細(xì)胞內(nèi)IL-2mRNA的含量：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。采用一步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。將RT-PCR產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝

6、膠電泳后，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)及凝膠分析軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行成像分析，用IL-2吸光度與B-actin吸光度的比值代表IL-2的相對(duì)含量。 6、所有數(shù)據(jù)均用X±S表示，用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，多組間比較用方差分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間比較用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、在PHA協(xié)同刺激下，細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后，倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞均呈現(xiàn)集落狀生長(zhǎng)，其中0.010ug/ml組細(xì)胞集落較

7、PHA對(duì)照組明顯增多，1.000ug/ml組細(xì)胞集落較PHA對(duì)照組減少。MTT結(jié)果顯示：斑蝥酸鈉維生素．B6注射液在一定范圍內(nèi)，能刺激外周血T淋巴細(xì)胞的增殖，且隨著藥物濃度的增高促增殖作用增強(qiáng)。但當(dāng)藥物達(dá)到一定濃度時(shí)，隨著濃度的增高促增殖作用減弱，達(dá)到較高濃度時(shí)甚至有殺傷T淋巴細(xì)胞的作用。其中促增殖作用最強(qiáng)的兩個(gè)濃度為0.010ug/ml和0.050ug/ml。 2、適當(dāng)濃度的斑蝥酸鈉維生素B6注射液可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化，促

8、進(jìn)細(xì)胞由G<,0>/G<,1>期向S期轉(zhuǎn)化。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的S期細(xì)胞百分率與對(duì)照組的S期細(xì)胞百分率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3、兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組IL-8的分泌與對(duì)照組相比降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 4、IL-4的分泌顯示出隨藥物濃度增高而增高的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 5、適當(dāng)濃度的斑蝥酸鈉維生素B6注射液可以促進(jìn)T細(xì)胞內(nèi)IL-2mRN

9、A的表達(dá)，兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。0.050ug/ml實(shí)驗(yàn)組的作用較0.010ug/ml實(shí)驗(yàn)組弱，且兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論： 1、在PHA協(xié)同刺激下，斑蝥酸鈉維生素B6注射液在體外對(duì)T淋巴細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用，這種促進(jìn)增殖作用是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞從G<,0>/G<,1>期向S期轉(zhuǎn)化而實(shí)現(xiàn)的。斑蝥酸鈉維生素B6注射液可能通過(guò)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖直接增強(qiáng)機(jī)體的

10、免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用。 2、當(dāng)斑蝥酸鈉維生素。B6注射液藥物濃度達(dá)0.010ug/ml，促增殖作用最明顯，0.050ug/ml促增殖作用也比較明顯，隨著藥物濃度的增加，促增殖作用減弱，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)出現(xiàn)抑制作用。提示我們臨床應(yīng)用斑螫酸鈉維生素B6注射液時(shí)濃度應(yīng)適宜。 3、斑蝥酸鈉維生素B6注射液可能通過(guò)下調(diào)淋巴細(xì)胞分泌趨化因子IL-8，進(jìn)而減少腫瘤血管生成而起到抗腫瘤作用。 4、斑蝥酸鈉維生素B6注射液雖有