硫化氫參對(duì)大鼠RVLM前交感神經(jīng)元的影響.pdf

1、背景:頭端延髓腹外側(cè)區(qū)(RVLM)在交感神經(jīng)張力和心血管功能調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。RVLM前交感神經(jīng)元直接投射到脊髓交感節(jié)前神經(jīng)元,使后者具有與其十分相似的放電活動(dòng),并且通過(guò)改變心交感神經(jīng)和交感縮血管神經(jīng)的傳出活動(dòng)調(diào)控心臟泵血和阻力血管的舒縮狀態(tài)。大約40％前交感神經(jīng)元在細(xì)胞染色學(xué)上屬于C1細(xì)胞,這種細(xì)胞具有合成腎上腺素的完整酶系,并且已被確定與血壓和血管張力調(diào)節(jié)密切相關(guān)。但不是所有在中樞內(nèi)的C1細(xì)胞都集中在RVLM內(nèi)；同時(shí),不是所有C1細(xì)

2、胞都與血壓和血管張力有關(guān)。同樣,前交感神經(jīng)元也包含非C1細(xì)胞,因此不可把C1細(xì)胞簡(jiǎn)單的等同于心血管中樞。但即使不能認(rèn)為前交感神經(jīng)元是支配交感/心血管張力的唯一細(xì)胞,它仍然是調(diào)解這些功能的關(guān)鍵。有資料提示,腦供血供氧減少時(shí)RVLM前交感神經(jīng)元活動(dòng)增強(qiáng),可能與高血壓心臟病有一定的關(guān)系。 近年來(lái),硫化氫(H2S)被認(rèn)為是一種新的氣體信號(hào)分子。硫化氫具有廣泛的生理學(xué)和病理學(xué)功能。它可易化海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(LTP),通過(guò)激活A(yù)TP依賴的

3、鉀離子通道(KATP)引起血管舒張、抑制促腎上腺皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)因子(CRF)釋放。 硫化氫易溶于水和脂質(zhì),因此可以迅速穿過(guò)細(xì)胞膜。體液中,硫化氫發(fā)生兩種可逆反應(yīng):H2S<->H++HS;H2S<->2H++S2-;其中H2S和HS-分別占溶液硫化物的30％和70％,而S2-的含量可忽略不計(jì)。 在許多外周組織和腦內(nèi)都發(fā)現(xiàn)毫摩爾級(jí)硫化氫,組織中硫化氫主要為含巰基氨基酸(L-半胱氨酸,高半胱氨酸)在丙氨酸-γ-裂解酶(CSE)和

4、丙氨酸-β-合成酶(CBS)作用下的代謝產(chǎn)物。由于硫化氫會(huì)迅速氧化,細(xì)胞內(nèi)氧化一還原狀態(tài),氧含量,以及硫化氫的生成動(dòng)態(tài)過(guò)程刀決定細(xì)胞內(nèi)硫化氫含量。硫化氫產(chǎn)生與高半胱氨酸代謝相關(guān),而后者與氧化應(yīng)激聯(lián)系。 CSE主要出現(xiàn)在心血管平滑肌細(xì)胞,而中樞合成硫化氫的關(guān)鍵酶為CBS。外周的硫化氫與一氧化氮共同作用控制血管張力,它主要通過(guò)ATP敏感鉀離子通道(KATP)發(fā)揮作用,激活該通道可引起細(xì)胞超極化和電壓依賴性鈣通道(VDCC)關(guān)閉,從而

5、導(dǎo)致平滑肌舒張。但是,硫化氫對(duì)中樞神經(jīng)細(xì)胞的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。 因此,研究硫化氫在對(duì)RVLM內(nèi)前交感神經(jīng)元的影響是富有意義的。實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)多管電極比較前交感神經(jīng)元在電泳硫氫化鈉前后放電頻率的變化研究硫氫化鈉對(duì)其影響。之后通過(guò)組織染色驗(yàn)證RVLM區(qū)域內(nèi)是否存在CBS,研究該區(qū)域存在內(nèi)源性硫化氫的可能性。 雖然在中樞低氧感受器的問(wèn)題上仍然存在爭(zhēng)議。但RVLM區(qū)域內(nèi)前交感神經(jīng)元確實(shí)具有一些對(duì)低氧敏感的特性。孤束核神經(jīng)元接受頸動(dòng)脈

6、體和呼吸中樞的傳入纖維,然后對(duì)RⅥM區(qū)域產(chǎn)生單突觸聯(lián)系,這個(gè)環(huán)路賦予某些前交感神經(jīng)元呼吸節(jié)律,并且構(gòu)成RVLM參與低氧反射的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。即使去除大鼠頸動(dòng)脈體的傳入神經(jīng),低氧也可增加膈神經(jīng)放電和增加交感神經(jīng)輸出,引起通氣反應(yīng)和血壓升高。 低氧環(huán)境下,動(dòng)物的RVLM內(nèi)C1細(xì)胞高度表達(dá)低氧誘導(dǎo)因子1-α(HIF1-α)和酪氨酸羥化酶,而且即使去除頸動(dòng)脈體神經(jīng)也不能削弱該反應(yīng)。這說(shuō)明C1細(xì)胞可能具有低氧敏感性。另外,在氰化鈉模擬局部缺氧的

7、離體實(shí)驗(yàn)中觀察到RVLM內(nèi)某些神經(jīng)元放電頻率增加。 由于實(shí)驗(yàn)室前期工作提示硫化氫可能參與了頸動(dòng)脈體低氧反應(yīng)的過(guò)程。因?yàn)樵陔x體實(shí)驗(yàn)中,硫化氫可以增加頸動(dòng)脈體在低氧環(huán)境下的放電頻率并縮短潛伏期。因而在實(shí)驗(yàn)的第二部分初步研究了用硫代硫酸鈉模擬低氧環(huán)境下前交感神經(jīng)元放電變化。 目的: 1.對(duì)前交感神經(jīng)元電泳硫化氫供體硫氫化鈉,觀察放電頻率的改變。 2、通過(guò)免疫組織化學(xué)方法,觀察RVLM區(qū)域是否具有CBS表達(dá)。

8、 3、對(duì)前交感神經(jīng)元電泳硫代硫酸鈉,用于模擬局部低氧,觀察放電頻率的改變。 材料與方法: 1.試驗(yàn)采用SD大鼠,用1％戊巴比妥(50mg/kg)麻醉大鼠后依次進(jìn)行氣管插管,雙側(cè)股靜脈插管和右側(cè)動(dòng)脈插管。監(jiān)視血壓和心電圖,持續(xù)輸注維庫(kù)溴銨維持肌松,施行人工通氣,并將大鼠頭部固定在立體定向儀上。隨后,去除大部分枕骨和小部分頂骨,吸除大部分小腦,暴露延髓。實(shí)驗(yàn)半小時(shí)靜脈推注戊巴比妥維持麻醉。 2.制作微電極,充入電

9、極液,然后固定于定向儀上。連接電信號(hào)放大器和多管微電泳儀。將電極移動(dòng)到RVLM區(qū)域上方的延髓表面,然后在立體定位儀的引導(dǎo)下插入電極。 3.尋找前交感神經(jīng)元,對(duì)其鑒定后電泳硫氫化鈉和硫代硫酸鈉,觀察放電改變。 結(jié)果: 1.在硫氫化鈉對(duì)前交感神經(jīng)元影響的實(shí)驗(yàn)中共有39個(gè)RVLM內(nèi)的神經(jīng)元,包括20個(gè)前交感神經(jīng)元和19個(gè)非前交感神經(jīng)元。觀察20個(gè)前交感神經(jīng)元微電泳硫氫化鈉30s引起的放電頻率變化,發(fā)現(xiàn)所有前交感神元都可

10、在適當(dāng)?shù)碾娪倦娏飨屡d奮。給與-30nA,-60nA和-90n電流后,分別有20,21,19個(gè)細(xì)胞被興奮。其中包括前交感神經(jīng)元19,20和18個(gè)。 2.硫氫化鈉可引起前交感神經(jīng)元放電頻率雙相變化,這三次電泳分別有9,11,13個(gè)細(xì)胞放電具有先增加后抑制的明顯變化。 3.在19個(gè)非前交感神經(jīng)元的放電頻率記錄中發(fā)現(xiàn)11個(gè)被硫氫化鈉抑制,8個(gè)對(duì)硫氫化鈉沒(méi)有明顯反應(yīng)。無(wú)一例被硫氫化鈉興奮3.在組織化學(xué)研究中,向包含RVLM部位的切

11、片上加入CBS特異性抗體作為一抗,結(jié)果表明神經(jīng)元臨近部位被染色。 4.在硫代硫酸鈉前交感神經(jīng)元影響的實(shí)驗(yàn)中紀(jì)錄38個(gè)RVLM內(nèi)的神經(jīng)元,包括20前交感神經(jīng)元和18個(gè)非前交感神經(jīng)元。以-60nA、-90nA和-120nA電泳時(shí),分別有25,27和25個(gè)神經(jīng)元放電增加。其中前交感神經(jīng)元個(gè)數(shù)分別是19,20,19。 結(jié)論: 1.硫氫化鈉對(duì)前交感神經(jīng)元具有先興奮后抑制的雙重作用。 2.RVLM神經(jīng)元比鄰部位存在C