轉(zhuǎn)染LMP-1基因人脂肪間充質(zhì)干細胞與退變髓核細胞體外雙層細胞微球三維條件下共培養(yǎng)的實驗研究.pdf

1、第一部分人退變髓核細胞的體外分離、培養(yǎng)擴增、鑒定及細胞微球三維培養(yǎng)與單層培養(yǎng)對其類軟骨表型的影響
　　 目的：探討人退變髓核細胞的體外分離、培養(yǎng)擴增及鑒定方法，并觀察細胞微球三維培養(yǎng)對其生物學特性的影響。
　　 方法：收集25例人退變椎間盤手術(shù)髓核標本組織，體外采用0.025％的Ⅱ型膠原酶消化法將原代髓核細胞分離并連續(xù)培養(yǎng)擴增傳代。利用倒置相差顯微鏡觀察髓核細胞形態(tài)變化，通過Ⅱ型膠原及aggrecan免疫熒光化學染色法鑒

2、定髓核細胞類軟骨表型分子的表達。分別采用常規(guī)單層培養(yǎng)和細胞微球三維培養(yǎng)退變髓核細胞，共設(shè)3個觀察時間點(7、14、21天)。通過RT-PCR方法檢測兩組細胞aggrecan、Ⅱ型膠原及SOX-9等基因的表達變化。
　　 結(jié)果：應(yīng)用0.025％的II型膠原酶37℃消化4小時即可分離出一定數(shù)量的原代人退變髓核細胞；體外培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)其平均8天貼壁，細胞呈梭形、類圓形或多角性，細胞達到80％融合平均約需4周。免疫熒光化學及甲苯胺藍染色法

3、檢測發(fā)現(xiàn)分離培養(yǎng)的髓核細胞可表達Ⅱ型膠原及aggrecan蛋白。RT-PCR檢測結(jié)果顯示細胞微球三維培養(yǎng)組髓核細胞aggrecan、Ⅱ型膠原蛋白及SOX-9基因的表達顯著高?。畣螌优囵B(yǎng)組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：采用0.025％的Ⅱ型膠原酶消化法可從退變椎間盤手術(shù)標本中分離出一定數(shù)量退變髓核細胞。該細胞呈類軟骨表型（表達蛋白多糖和Ⅱ型膠原）。與常規(guī)單層培養(yǎng)相比，細胞微球三維培養(yǎng)可較好地保持其類軟骨表型。
　　 第二

4、部分人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞體外分離、培養(yǎng)擴增、鑒定及單層與三維誘導環(huán)境對其成軟骨分化效應(yīng)的影響
　　 目的：體外分離、培養(yǎng)擴增人脂肪組織米源的間充質(zhì)干細胞，并通過流式細胞儀及多向誘導分化對其干細胞特性進行鑒定。
　　 方法：取10例剖腹產(chǎn)手術(shù)皮下脂肪標本，采用0.075％的Ⅰ型膠原酶消化法結(jié)合反復(fù)貼壁法分離培養(yǎng)并純化人脂肪間充質(zhì)干細胞；倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，流式細胞儀檢測干細胞表型分子。隨后分別在單層和細胞

5、微球三維環(huán)境下誘導人脂肪間充質(zhì)干細胞定向成脂、成骨及成軟骨分化，并采用油紅O染色、Alizareen染色、Safranin'O染色、甲苯胺藍染色、aggrecan及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色法檢測。此外，應(yīng)用RT-PCR方法檢測單層誘導和細胞微球三維誘導環(huán)境下，人脂肪干細胞成軟骨分化后的基因表達。
　　 結(jié)果：應(yīng)用0.075%的Ⅰ型膠原酶37℃消化約1小時即可分離出較多的人脂肪間充質(zhì)干細胞。原代人脂肪干細胞平均3天貼壁，達到80%

6、融合約需9天；傳至3代后，轉(zhuǎn)變成均一的長梭形，并早漩渦狀排列。流式細胞儀檢測分析發(fā)現(xiàn)人脂肪間充質(zhì)干細胞高表達CD29、CD90、CD105分子，低表達CD34、CD45分子及HLA-DR。單層環(huán)境下多向誘導21天后，油紅O染色、Alizareen染色、Safranin'O染色均呈陽性。細胞微球三維環(huán)境下成軟骨誘導21天后，細胞團呈明顯的軟骨樣形態(tài)，切片HE染色可見清晰的軟骨特征樣的細胞和細胞外基質(zhì)分層排列。甲苯胺藍、Masson三色染色

7、、及Ⅱ型膠原、aggrecan免疫組化染色均呈陽性。RT-PCR結(jié)果顯示細胞微球三維環(huán)境下誘導的人脂肪干細胞軟骨樣表型基因（aggrecan、Ⅱ型膠原及SOX-9）高于單層誘導組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：通過Ⅰ型膠原酶消化結(jié)合反復(fù)貼壁法可獲得大量純化的人脂肪間充質(zhì)干細胞，該細胞體外具有多向分化潛能，并且細胞微球三維誘導環(huán)境更適合其成軟骨分化。
　　 第三部分攜帶LMP-1-GFP基因的慢病毒載體構(gòu)建、鑒定、轉(zhuǎn)染人脂

8、肪干細胞及LMP-1基因?qū)毎⑶蛉S誘導環(huán)境下人脂肪間充質(zhì)干細胞成軟骨分化效應(yīng)的影響
　　 目的：構(gòu)建攜帶人LMP-1基因的慢病毒載體并對其進行鑒定，以獲得高滴度的攜帶LMP-1基因慢病毒載體用于脂肪干細胞的轉(zhuǎn)染。觀察LMP-1基因?qū)毎⑶蛉S誘導環(huán)境下人脂肪間充質(zhì)干細胞成軟骨分化效應(yīng)的影響。
　　 方法：根據(jù)人LMP-1基因（GeneBank序號：NM005451）mRNA，設(shè)計并合成全基因的引物。從購買的cDNA

9、文庫中，利用PCR方法釣取目的基因。將目的基因與酶切線性化的載體進行定向交換，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細菌感受態(tài)細胞。對長出的克隆先進行菌落PCR鑒定，再對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和比對分析，比對正確的克隆即為構(gòu)建成功的目的質(zhì)粒。最后將構(gòu)建好的融合蛋白表達載體進行超純?nèi)?nèi)毒素抽提得到較高滴度、可表達LMP-1-GFP基因及GFP基因的慢病毒載體。并分別用于轉(zhuǎn)染脂肪干細胞得到表達LMP-1-GFP基因或GFP基因的人脂肪干細胞。將轉(zhuǎn)染LMP-1-G

10、FP基因和GFP基因的人脂肪干細胞分別置于細胞微球三維環(huán)境中進行成軟骨誘導分化。其中，轉(zhuǎn)染LMP-1-GFP基因的脂肪干細胞分別采用含TGF-β3的成軟骨誘導基和不含TGF-β3的成軟骨基礎(chǔ)誘導基進行成軟骨誘導，同時用含TGF-β3的軟骨誘導基對單純表達GFP基因的脂肪干細胞進行成軟骨誘導并設(shè)為對照組。誘導21天后，采用RT-PCR方法檢測各組誘導細胞軟骨表型基因的表達，觀察LMP-1基因能否誘導細胞微球三維環(huán)境下人脂肪干細胞成軟骨分化

11、及其與TGF-β3誘導效應(yīng)之間是否存在差異。
　　 結(jié)果：通過上述方法獲得了高滴度(2x109TU/ml)的攜帶LMP-1基因的慢病毒。成軟骨誘導對比實驗表明TGF-β3誘導的轉(zhuǎn)染LMP-1基因的人脂肪干細胞成軟骨分化效應(yīng)最強，其次為采用不含TGF-β3的成軟骨基礎(chǔ)誘導基誘導的轉(zhuǎn)染LMP-1基因的脂肪干細胞，而采用含TGF-β3的成軟骨誘導基誘導的轉(zhuǎn)染GFP基因的人脂肪干細胞分化效應(yīng)相對較弱，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05

12、)。
　　 結(jié)論：慢病毒是一種良好的基因轉(zhuǎn)導載體工具，可有效地轉(zhuǎn)染人脂肪干細胞并獲得相關(guān)基因大量表達。與BMP-2、-7成軟骨效應(yīng)類似，LMP-1基因也可誘導細胞微球三維誘導環(huán)境下人脂肪干細胞成軟骨分化，并且該效應(yīng)高于傳統(tǒng)的誘導因子TGF-β3。此外，兩者之間存在協(xié)同效應(yīng)。
　　 第四部分雙層細胞微球三維共培養(yǎng)環(huán)境下人脂肪間充質(zhì)干細胞與退變髓核細胞間相互效應(yīng)的觀察及LMP-1基因?qū)υ撔?yīng)的影響
　　 目的：觀察并

13、檢測LMP-1基因?qū)θ酥鹃g充質(zhì)干細胞與退變髓核細胞在雙層微球微球共培養(yǎng)環(huán)境下相互效應(yīng)的影響，并分析相關(guān)機制。
　　 方法：采用攜帶LMP-1-GFP或GFP基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人脂肪間充質(zhì)干細胞，獲得表達LMP-1-GFP或GFP基因的人脂肪干細胞。將其與退變髓核細胞在雙層細胞微球三維環(huán)境下共培養(yǎng)，同時設(shè)立混合細胞微球三維共培養(yǎng)及單獨細胞微球三維培養(yǎng)組作為對照。共設(shè)立7個細胞培養(yǎng)組，分別為轉(zhuǎn)染GFP基因脂肪干細胞三維細胞微球單

14、獨培養(yǎng)組，轉(zhuǎn)染GFP基因脂肪干細胞與退變髓核細胞混合細胞微球三維共培養(yǎng)組、轉(zhuǎn)染GFP基因脂肪干細胞與退變髓核細胞雙層細胞微球三維共培養(yǎng)組、轉(zhuǎn)染LMP-1-GFP基因脂肪干細胞三維細胞微球單獨培養(yǎng)組、轉(zhuǎn)染LMP-1-GFP基因脂肪干細胞與退變髓核細胞混合細胞微球三維共培養(yǎng)組、轉(zhuǎn)染LMP-1-GFP基因脂肪干細胞與退變髓核細胞雙層細胞微球三維共培養(yǎng)組及髓核細胞三維細胞微球單獨培養(yǎng)組。設(shè)立3個觀察時間點：7、14、21天，采用阿利新藍法檢測各

15、自蛋白聚糖含量，并通過流式細胞分選方法將表達GFP基因的脂肪干細胞與GFP表達陰性髓核細胞分離開來，采用RT-PCR方法檢測共培養(yǎng)脂肪干細胞和退變髓核細胞各白aggrecan、Ⅰ、Ⅱ型膠原及SOX-9基因表達變化，并與單獨培養(yǎng)組相比較。此外，我們還采用Westem-blot蛋白免疫電泳法對各培養(yǎng)組脂肪干細胞上述基因變化在蛋白水平的表達進行了檢測。
　　 結(jié)果：自培養(yǎng)的第14天起，雙層細胞微球三維共培養(yǎng)組蛋白多糖合成高于其余各細胞

16、培養(yǎng)組(P＜0.05)，此外，轉(zhuǎn)染LMP-1-GFP基因脂肪干細胞與髓核細胞共培養(yǎng)組蛋白多糖合成量顯著高于轉(zhuǎn)染GFP基因脂肪干細胞與髓核細胞共培養(yǎng)組(P＜0.05)。RT-PCR檢測顯示，自培養(yǎng)第7大起，細胞微球三維共培養(yǎng)組髓核細胞Ⅱ型膠原、SOX-9及Aggrecan等基因表達均高于單獨髓核細胞三維微球培養(yǎng)組(P＜0.05)。但雙層細胞微球三維共培養(yǎng)組髓核細胞上述基因表達與混合細胞微球三維共培養(yǎng)組髓核細胞表達無顯著性差異(P＞0.05

17、)。此外，與轉(zhuǎn)染LMP-1-GFP基因脂肪干細胞共培養(yǎng)髓核細胞Ⅱ型膠原、SOX-9及Aggrecan基因表達高于與轉(zhuǎn)染GFP基因脂肪干細胞共培養(yǎng)髓核細胞(P＜0.05)。此外，所有細胞微球三維培養(yǎng)組髓核細胞Ⅰ型膠原基因表達均隨時間增長逐漸降低(P＜0.05)。除Ⅰ型膠原外，脂肪干細胞三維細胞微球單獨培養(yǎng)組未見上述基因表達。雙層細胞微球三維共培養(yǎng)組脂肪干細胞上述基因表達高于混合細胞微球三維共培養(yǎng)組(P＜0.05)。此外，轉(zhuǎn)染LMP-1-G

18、FP基因脂肪干細胞上述基因表達高于轉(zhuǎn)染GFP基因脂肪干細胞(P＜0.05)。三維細胞微球單獨培養(yǎng)組脂肪干細胞Ⅰ型膠原基因表達逐漸增高，但細胞微球三維共培養(yǎng)組脂肪干細胞Ⅰ型膠原基因表達呈逐漸下降趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P＜O.05)。此外，除Ⅰ型膠原外，雙層細胞微球三維共培養(yǎng)組轉(zhuǎn)染GFP基因脂肪干細胞上述基因表達高于混合細胞微球三維共培養(yǎng)組轉(zhuǎn)染LMP-1基因脂肪干細胞(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：雙層細胞微球三維共培養(yǎng)較混合細胞