CD44v6與nm23在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義.pdf

1、神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Nuroblastoma，NB)是起源于腎上腺和脊柱旁的交感神經(jīng)鏈，由未分化的交感神經(jīng)細(xì)胞所組成，該瘤生長迅速，轉(zhuǎn)移早，惡性程度高，且臨床療效差。是小兒最常見的惡性實(shí)體瘤之一，僅次于腎母細(xì)胞瘤，好發(fā)部位為腎上腺及脊柱旁交感神經(jīng)鏈，大部分發(fā)生于腹膜后，胸部較少見；多發(fā)年齡為6歲以下的嬰幼兒，以男性多見；一般首診時(shí)已屬晚期。近年來，隨著超聲及影像學(xué)檢查發(fā)展，臨床對癥支持治療如術(shù)后監(jiān)護(hù)水平的提高，神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒總的治愈率卻提高

2、不大，腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移仍是臨床面臨的主要難題，且是導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒死亡主要原因。目前，運(yùn)用分子生物學(xué)手段探索神經(jīng)母細(xì)胞瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移機(jī)制成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。
　　 CD44是位于人類第11號染色體短臂上的基因，其表達(dá)產(chǎn)物是細(xì)胞膜表面跨膜糖蛋白粘附分子[3]，即透明質(zhì)酸分子受體。有研究表明許多發(fā)生浸潤及轉(zhuǎn)移的腫瘤，幾乎都有該變異型基因CD44v6的過度表達(dá)。CD44v6可在多種信號途徑中的酶及離子的作用下，促進(jìn)腫瘤周圍血管生

3、成，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性[4]，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移。
　　 Steeg1等從鼠黑色素瘤亞細(xì)胞克隆中分離出位于染色體17q21.的nm23基因，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，片段長約10kb，是公認(rèn)的具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移功能的基因，通過G蛋白信號途徑發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，影響細(xì)胞的增殖分化與凋亡及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。
　　 目的：
　　 目前，NB的研究方法多集中在體外細(xì)胞培養(yǎng)方面，而腫瘤的發(fā)生發(fā)展是受機(jī)體復(fù)雜內(nèi)環(huán)境綜合作用的

4、結(jié)果，體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長環(huán)境與機(jī)體環(huán)境存在差異，本實(shí)驗(yàn)收集神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒術(shù)中腫瘤組織及正常組織作為標(biāo)本，采用RT-PCR和免疫組化方法檢測標(biāo)本中CD44v6和nm23mRNA及其蛋白表達(dá)狀況，分析其與腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，旨在尋找可以預(yù)測患兒病情預(yù)后的指標(biāo)，為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1．選擇實(shí)驗(yàn)對象、采集組織標(biāo)本、整理患者的臨床資料
　　 收集2008年2月-2010年5月在鄭州大

5、學(xué)第三附屬醫(yī)院及一附院小兒外科手術(shù)切除神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織及正常組織(距腫瘤5cm)各40例，分別作為研究組和對照組。同時(shí)搜集患者的性別，臨床分期，病理類型，以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面的臨床資料，用于統(tǒng)計(jì)分析和研究。
　　 2．PCR步驟
　　 1設(shè)計(jì)引物，在GenBank檢索人β-actin、CD44v6和nm23編碼基因序列，利用Primer引物設(shè)計(jì)軟件分別對CD44v6和nm23基因的上下游引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，均設(shè)計(jì)在2個(gè)外顯

6、子的連接處，以確保引物核苷酸序列不具有DNA多態(tài)性，避免DNA污染。
　　 2依據(jù)Trizol試劑說明書，分別提取研究組和正常組織標(biāo)本的mRNA。
　　 3使用逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV（莫洛尼氏鼠白血病病毒）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對提取的CD44v6和nm23mRNA分別進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄。
　　 4分別采用適當(dāng)溫度試驗(yàn)性擴(kuò)增內(nèi)參β-actin、CD44v6和nm23cDNA。最適溫度下所得擴(kuò)增產(chǎn)物即為RT-PCR產(chǎn)物。

7、　　 5制作瓊脂糖凝膠，同時(shí)加入溴化乙錠，將擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠內(nèi)進(jìn)行電泳。經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)攝影，用相應(yīng)軟件掃描儀測定PCR產(chǎn)物表達(dá)量。
　　 6免疫組化方法檢測CD44v6和nm23兩種蛋白的表達(dá)情況。陽性細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)著色，按照染色結(jié)果的強(qiáng)度分別進(jìn)行計(jì)分。
　　 7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，獨(dú)立樣本組間比較采用t檢驗(yàn)等方法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以s±(x)表示,P＜

8、0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1 CD44v6mRNA在腫瘤組織中表達(dá)水平高于正常組織，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2 nm23mRNA表達(dá)水平在腫瘤組織中低于正常組織，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組。
　　 3 CD44v6蛋白陽性表達(dá)率在腫瘤組織中高于瘤旁正常組織，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，Ⅲ-Ⅳ期組明顯高于Ⅰ-Ⅱ期組。