鼻息肉成纖維細(xì)胞在常氧與低氧環(huán)境下的原代培養(yǎng)及鑒定.pdf

1、目的:探討人鼻息肉的成纖維細(xì)胞在常氧與低氧環(huán)境下的細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定，以備下一步為研究鼻息肉成纖維細(xì)胞的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供比較優(yōu)良的細(xì)胞系，及后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究人鼻息肉的成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　方法:取山東大學(xué)齊魯醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科2012年10月～2013年3月的住院患者，經(jīng)行鼻內(nèi)鏡下鼻息肉切除手術(shù)的息肉組織共20例。取出息肉后立即將息肉標(biāo)本放入4℃的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)中，在超凈臺(tái)上培養(yǎng)皿中用PBS溶液反復(fù)沖洗、浸

2、泡息肉組織，去除組織內(nèi)的紅細(xì)胞及分泌物。將洗好息肉組織剪成1～2mm大小的組織塊后，分成2份轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的EP管中，分別把1ml的0.1％Ⅰ型膠原蛋白酶和1ml的dispaseⅡ酶放入2個(gè)EP管中消化過夜。次日取出組織后，放入10ml的離心管中用移液槍輕輕吹打消化后的組織，分離出更多的細(xì)胞。分別對(duì)2種酶消化后得到的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后，移入60mm培養(yǎng)皿中，加入組織培養(yǎng)液（DMEM+10％胎牛血清+100mg/L鏈霉素+1×105U/L青霉素

3、）后，分別放在常氧與低氧環(huán)境下進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)。（常氧原代培養(yǎng)是以普通空氣作為培養(yǎng)箱內(nèi)的混合氣體，控制氧體積分?jǐn)?shù)含量為20％;低氧原代培養(yǎng)則是利用氮?dú)庾鳛榕囵B(yǎng)箱內(nèi)的混合氣體，調(diào)控氧體積分?jǐn)?shù)含量至5％。二種原代培養(yǎng)方法的其他培養(yǎng)環(huán)境均一致，都是37℃的溫度，相對(duì)飽和濕度和含體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2。）利用倒置相差顯微鏡，在鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)繁殖狀況、有無污染。最后對(duì)人鼻息肉成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)的鑒定后，再用波形蛋白單克

4、隆抗體對(duì)培養(yǎng)后的原代細(xì)胞行免疫組化染色鑒定。用CCK-8比色法檢測(cè)成纖維細(xì)胞的增殖變化，描繪其生長(zhǎng)曲線。
　　結(jié)果:dispaseⅡ酶消化組的細(xì)胞數(shù)目明顯高于Ⅰ型膠原酶消化組，兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)?？梢詮娜吮窍⑷饨M織中分離出成纖維細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行原代培養(yǎng)后，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)呈梭形、星形、不規(guī)則形或多突的紡錘形，胞核較大呈圓形或橢圓形，細(xì)胞胞質(zhì)向外突出，一般有2～3個(gè)長(zhǎng)短不齊的觸角，細(xì)胞中央有卵圓

5、形細(xì)胞核。在細(xì)胞密度高時(shí)，細(xì)胞之間的排列方式多為平行排列，或呈放射狀、漩渦狀排列。對(duì)本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行波形蛋白單克隆抗體免疫組化染色，免疫組化染色后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕色或棕褐色的標(biāo)志物者為陽性細(xì)胞，證實(shí)其為成纖維細(xì)胞。在常氧及低氧環(huán)境下培養(yǎng)的人鼻息肉成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線無明顯差異。
　　結(jié)論:經(jīng)dispaseⅡ酶消化的組織細(xì)胞數(shù)目較多，是一種較好獲得組織細(xì)胞的技術(shù)方法。本實(shí)驗(yàn)中在常氧及低氧環(huán)境下，均可建立比較穩(wěn)定、可靠的人體鼻腔鼻黏