急性運動軸索型神經(jīng)病患者血清對體外培養(yǎng)脊髓運動神經(jīng)元影響的比較蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、河北醫(yī)科大學碩士學位論文急性運動軸索型神經(jīng)病患者血清對體外培養(yǎng)脊髓運動神經(jīng)元影響的比較蛋白質(zhì)組研究姓名：魏曉珊申請學位級別：碩士專業(yè)：神經(jīng)病學指導教師：楊國鋒20090301中文摘要方法：1 ．血清的獲得：選取符合美國國立衛(wèi)生研究院擬訂的G B S 診斷標準的G B S 急性期患者，依據(jù)C o m b l a t h 標準明確劃分為A M A N ，抽取靜脈血離心后獲得血清；健康人血清由河北省血液中心惠贈。所得血清均．8 0 0 C 保

2、存。2 ．細胞培養(yǎng)：取S ．D 大鼠胚胎脊髓腹側(cè)半進行原代體外運動神經(jīng)元的分離培養(yǎng)，在培養(yǎng)第6 天，神經(jīng)元生長旺盛期，給予2 0 ％A M A N 患者血清進行干預，對照組為正常健康人血清，2 小時后收集細胞。3 ．蛋白提?。簯昧呀庖? 9 M u r e a ，4 ％w ／v C H A P S ，1 ％w ／vD T T , O ．5 ％C A a n d a c o c k t a i lo f p r o t e a s ei

3、 n h i b i t o r s ) ，超聲震蕩法提取神經(jīng)元蛋白。4 ．雙向凝膠電泳：神經(jīng)元蛋白質(zhì)以固相p H 梯度等電聚焦為第一向，S D S ．P A G E 垂直電泳為第二向進行雙向電泳。得到的雙向電泳凝膠固定后以鍍銀或考馬斯亮蘭R 2 5 0 染色。5 ．凝膠圖像分析：圖象分析軟件I m a g e m a s t e r2 D 分析電泳圖譜。比較蛋白質(zhì)斑點差異，以正常血清干預的雙向電泳凝膠為參考膠，A M A N 患者血清

4、干預的凝膠與之比較，根據(jù)斑點的位置、大小、形狀等參數(shù)，軟件自動將不同圖譜中的相同蛋白質(zhì)點匹配，不能匹配的蛋白質(zhì)點及表達量上調(diào)或下調(diào)超過5 0 ％的蛋白質(zhì)點視為差異點。6 ．膠內(nèi)蛋白質(zhì)酶解：將蛋白質(zhì)點從考馬斯亮蘭染色的凝膠上切下后，加入l o o I J L l2 5 m M N H 4 H C 0 3 ／5 0 ％乙腈，振蕩除去考馬斯亮蘭染料，凝膠顆粒用凍干機凍干，應用胰蛋白酶進行酶切。7 ．質(zhì)譜鑒定：M A L D I ．T O F