早期ACM大鼠心臟中MMPs、TIMPs表達(dá)變化小檗堿干預(yù)作用的研究.pdf

1、本研究分為兩部分。
　　第一部分 MMPs、TIMPs在大鼠早期酒精性心肌病心肌組織中的表達(dá)及作用
　　 目的:建立大鼠早期ACM模型為進(jìn)一步研究人類ACM發(fā)病機(jī)制及預(yù)防、治療藥物提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)觀察基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)及其基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2(TIMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)在大鼠早期ACM發(fā)生、發(fā)展中心肌組織中的表達(dá)、變化情況，并分

2、析其與心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)、心肌組織中丙二醛(MDA)、心臟結(jié)構(gòu)及功能參數(shù)(LVEDD、LVESD、LA、E/A、EF、FS)等的相關(guān)關(guān)系，探討其在早期ACM心肌病變發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制，為臨床研究ACM發(fā)病機(jī)制尋找新思路提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:選擇成年健康SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，體重250～300g，隨機(jī)分為兩組:模型組（24只）、正常對(duì)照組(24只)，用白酒灌胃法制

3、備大鼠ACM的動(dòng)物模型，正常對(duì)照組每日予以等容積5％葡萄糖溶液灌胃。定期檢測(cè)大鼠一般情況，在灌胃后4周末、8周末、12周末、16周末各組隨機(jī)抽取5只大鼠，予以超聲心動(dòng)圖檢查;取部分心肌組織勻漿后用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定心肌組織中MDA的含量，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定心肌組織中SOD的含量;用RT-PCR法檢測(cè)心肌組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2mRNA的表達(dá)情況;常規(guī)心臟HE染色病理切片，觀察心肌組織的病理變化

4、。收集并整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)用t檢驗(yàn)、直線相關(guān)分析等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:(1)酒精灌胃后，大鼠輕者行走不穩(wěn)，活動(dòng)亢進(jìn)，重者出現(xiàn)嗜睡癥狀，身體癱軟，刺激后無(wú)明顯反應(yīng)，眼結(jié)膜充血，大約60分鐘后以上癥狀消失;隨著時(shí)間推移，后期實(shí)驗(yàn)中（灌胃4周后），模型組大鼠少食、少動(dòng)，大便稀，毛色發(fā)黃，無(wú)光澤，體態(tài)呆板、行動(dòng)遲緩、反應(yīng)遲鈍、嗜睡，易激惹，體重增長(zhǎng)緩慢。
　　 (2)第4周末，模型組大鼠心肌組織中

5、MDA升高，高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，SOD反之，且隨著時(shí)間的推移，酒精攝入量的增多，心肌組織中MDA逐漸增高，SOD活性下降，從第8周末開(kāi)始模型組大鼠出現(xiàn)左心擴(kuò)大、左室舒張功能減低，心肌組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、 TIMP-2mRNA表達(dá)水平上調(diào)， TIMP-2/MMP-2和TIMP-1/MMP-9比值下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在16周末顯微鏡下顯示心臟形態(tài)學(xué)變化:心肌細(xì)胞肥大，心肌纖

6、維排列紊亂，心肌間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)合超聲結(jié)果提示在此實(shí)驗(yàn)條件下，早期ACM大鼠模型建立成功。
　　 (3)相關(guān)關(guān)系:將各組大鼠心肌組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2mRNA表達(dá)情況及TIMP-2/MMP-2、TIMP-1/MMP-9比值與心臟結(jié)構(gòu)和功能參數(shù)等進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示:MMP-2和MMP-9與大鼠心臟結(jié)構(gòu)大小（LVEDD、LVESD、LA）、心肌組織中MDA均存在正相關(guān)關(guān)系，而TIMP-2/M

7、MP-2、TIMP-1/MMP-9與之負(fù)相關(guān)(P均＜0.01);MMP-2、MMP-9與心肌組織中SOD、E/A顯著負(fù)相關(guān)，TIMP-2/MMP-2和TIMP-1/MMP-9比值與之顯著正相關(guān)（P均＜0.01）。
　　 結(jié)論:在本實(shí)驗(yàn)條件下，早期ACM大鼠模型制備成功，在大鼠早期ACM的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，酒精導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞，引起心肌組織中MDA升高、SOD下降，引發(fā)MMP-2、MMP-9和TIMP-1、TIMP-2水平

8、進(jìn)行性增高，并使TIMP-2/MMP-2和TIMP-1/MMP-9比值失衡，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解，心肌膠原代謝失衡，心肌纖維化，導(dǎo)致心臟重構(gòu)，心功能下降，提示MMPs/TIMPs表達(dá)失衡參與ACM左室重構(gòu)和心功能下降的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。
　　
　　 第二部分小檗堿對(duì)早期ACM大鼠模型的治療作用及機(jī)制的研究
　　 目的:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠早期ACM模型予以小檗堿(BBR)干預(yù)治療，觀察BBR對(duì)治療前后早期ACM

9、大鼠心肌組織中MDA和SOD，心肌組織中MMPs及TIMPs基因表達(dá)、心臟結(jié)構(gòu)和功能參數(shù)及形態(tài)學(xué)變化的影響，探討B(tài)BR對(duì)早期ACM大鼠心臟保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為該藥在臨床研究與治療ACM提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:選擇與第一部分同源同批次的成年健康SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，隨機(jī)抽取SD大鼠10只作為正常對(duì)照組，另30只SD大鼠參照第一部分實(shí)驗(yàn)方法建立早期大鼠ACM模型。將建立成功的早期ACM模型的SD大鼠（24只）隨機(jī)分為小

10、檗堿治療組（以下簡(jiǎn)稱:BBR組）、安慰劑對(duì)照組（以下簡(jiǎn)稱:安慰劑組），每組12只。BBR組予以BBR200mg/kg/d，灌胃4周，安慰劑組和正常組予以等量蒸餾水灌胃4周。干預(yù)4周后超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能;用TBA法測(cè)定心肌組織中MDA的含量，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定心肌組織中SOD的含量;RT-PCR檢測(cè)MMPs及TIMPs基因在心肌組織中的表達(dá);心臟切片HE染色觀察形態(tài)學(xué)變化。
　　 結(jié)果:(1)白酒灌胃大鼠建立早

11、期ACM大鼠模型，16周末對(duì)全部存活大鼠行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，均顯示為:左心擴(kuò)大、左室舒張功能下降，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并從中隨機(jī)抽取4只大鼠行病理切片HE染色，顯微鏡下顯示:心肌細(xì)胞肥大，心肌纖維排列紊亂，心肌間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。通過(guò)以上綜合評(píng)定，提示早期ACM大鼠模型建立成功。建模分組后，BBR組和安慰劑組大鼠體重、心臟大小及功能均無(wú)顯著性差異，條件齊同。
　　 (2)干預(yù)4周后，BBR組與安慰劑組比

12、較，心肌組織中SOD升高，MDA下降，LVEDD、LVESD、LA減小，Em/Am比值上升，心肌組織中的MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2mRNA表達(dá)水平顯著下降，TIMP-2/MMP-2和TIMP-1/MMP-9比值升高（P均＜0.05）。BBR組顯微鏡下顯示部分心肌細(xì)胞肥大，心肌間質(zhì)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管壁結(jié)構(gòu)正常、無(wú)破裂。
　　 結(jié)論:BBR可能通過(guò)提高心肌組織中SOD活性，抑制MDA生成，減少刺激心肌組織中