Notch4通路與LCWE誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈損傷關(guān)系的初步探討.pdf

1、目的:
　　借助于LCWE誘導(dǎo)的川崎病冠狀動(dòng)脈炎的小鼠模型，探究Notch4信號(hào)通路在川崎病免疫性冠狀動(dòng)脈炎中的作用。
　　方法:
　　干酪乳桿菌購自CICC（中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心），取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌用于所有實(shí)驗(yàn)。
　　第一部分:LCWE誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈炎動(dòng)物模型的建立
　　干酪乳桿菌首先在MRS broth中培養(yǎng)24小時(shí)，SDS過夜裂解細(xì)菌，依次加入RNase，DNase和胰酶，超聲處理破碎細(xì)胞，

2、離心取上清，使用硫酸-苯酚比色法檢測(cè)上清液中糖總量。向BALB/c小鼠腹腔注射LCWE0.5ml(處理組)和PBS0.5ml（對(duì)照組），3天、7天、14天及28天后處死小鼠，取心臟和脾臟用4％多聚甲醛中常規(guī)固定，HE染色觀察心臟和脾臟的病理變化。使用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)脾臟Th1/Th2細(xì)胞因子譜的變化。
　　第二部分:Notch4通路與LCWE誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈損傷關(guān)系
　　3天、7天、14天及28天摘除小鼠眼球

3、取血，先后加入cd34-eFlour66010ul， Flk-1 FITC2ul，Notch4-PE5ul，cd45-PE-Cy5.50.5ul孵育，上機(jī)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中EPCs含量及其表面Notch4表達(dá)情況。設(shè)計(jì)引物GAPDH、Notch4、RBP-JK、vcam-1和P-selectin，使用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)胸主動(dòng)脈、心肌組織Notch4、RBP-JK、vcam-1和P-selectin mRNA表達(dá)情況。

4、使用免疫組化技術(shù)檢測(cè)胸主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈起始部vcam-1和P-selectin表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　第一部分:LCWE誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈炎動(dòng)物模型的建立
　　1.3天時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠體重明顯減輕。
　　2.心肌HE染色顯示各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組冠狀動(dòng)脈及其分支靠血管外膜處出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　3.實(shí)驗(yàn)組脾臟大體觀察脾臟體積增大，重量增加，HE染色發(fā)現(xiàn)各時(shí)間點(diǎn)主要以脾小體增生，融合。
　　4.實(shí)驗(yàn)組除IL-6外

5、，其他Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)量顯著增加。
　　第二部分:Notch4和RBP-JK與冠狀動(dòng)脈損傷相關(guān)
　　1.LCWE注射3天小鼠外周血循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的含量顯著高于對(duì)照組，14天時(shí)實(shí)驗(yàn)組EPCs含量低于對(duì)照組;LCWE注射7天EPCs表面Notch4表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。
　　2.14天，28天實(shí)驗(yàn)組胸主動(dòng)脈P-selectin mRNA和RBP-JK mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，P-selectin與RBP-

6、JK，Notch4與vcam-1顯著相關(guān);心肌中P-selectin與RBP-JK顯著相關(guān)。
　　3.實(shí)驗(yàn)組冠狀動(dòng)脈起始部血管內(nèi)皮細(xì)胞vcam-1表達(dá)除7天外，各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均不同程度升高，其中以3天組升高最為明顯;胸主動(dòng)脈中段實(shí)驗(yàn)組3，7天vcam-1表達(dá)高于對(duì)照組，但表達(dá)強(qiáng)度不及3天冠脈起始部;實(shí)驗(yàn)組P-selectin冠脈起始部14天，28天表達(dá)高于對(duì)照組，胸主動(dòng)脈中段14天時(shí)強(qiáng)于對(duì)照組。
　　結(jié)論:
　　1.循環(huán)