羧酸酯酶1A2基因多態(tài)性對氯吡格雷代謝及抗血小板活性影響研究.pdf

1、目的:通過羧酸酯酶1A2(CES1A2)對人肝微粒體體系中氯吡格雷體外代謝和中國健康志愿者口服氯吡格雷的藥代動力學(xué)及藥效學(xué)影響的研究,系統(tǒng)探討CES1A2基因多態(tài)性在氯吡格雷代謝和抗血小板活性差異中的作用,以期為臨床氯吡格雷合理使用提供依據(jù)。
　　方法:
　　(1)基因型測定:用Promega試劑盒提取肝組織和EDTA抗凝的全血中的DNA,用PCR-RFLP法測定CYP2C19*2/*3基因型,并隨機(jī)抽取樣本率不少于10％用

2、直接測序?qū)Ψ椒▽W(xué)進(jìn)行驗證;用直接測序法測定CES1A2 A(-816)C基因型。
　　(2)氯吡格雷及其活性和非活性代謝產(chǎn)物濃度測定:人肝微粒體孵育體系和人血漿中氯吡格雷及其活性和非活性代謝產(chǎn)物濃度均用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法測定。
　　(3)人肝微粒體孵育體系中CES1A2不同基因型下氯吡格雷的體外代謝測定:根據(jù) CYP2C19*2及*3突變基因的數(shù)目將肝組織分為三種代謝表型:快代謝者[EMs(CYP2

3、C19*1/*1)],中間代謝者[IMs(CYP2C19*1/*2,*1/*3)]和弱代謝者[PMs(CYP2C19*2/*2,*2/*3或*3/*3)]。在根據(jù)CYP2C19分型后的肝組織中,分別隨機(jī)抽取CES1A2不同基因型肝組織(CYP2C19 EM型中CES1A2-816AA,AC和CC各6例;CYP2C19 IM型中AA和AC各6例,未檢出CC型);同種基因型肝組織合并后進(jìn)行氯吡格雷體外代謝試驗,考察CES1A2催化氯吡咯雷生

4、成非活性代謝產(chǎn)物的酶促反應(yīng)動力學(xué)特征,同時測定CES1A2不同基因型氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物生成的情況。利用 Graphpad5.0軟件擬合底物濃度與反應(yīng)速率的非線性回歸方程:單位點的Michaelis-Menten方程,計算氯吡咯雷非活性代謝產(chǎn)物的體外代謝酶促反應(yīng)的表觀動力學(xué)常數(shù)Vmax和Km,求得內(nèi)在清除率Clint(Vmax/Km)。三組基因型肝微粒體中非活性代謝產(chǎn)物生成的酶動力學(xué)參數(shù)和活性代謝產(chǎn)物生成水平的比較采用單因素方差分析(A

5、NOVA),三組基因型中的兩兩比較采用LSD(least significant difference)事后檢驗或t檢驗。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　(4)中國健康志愿者藥代動力學(xué)-藥效學(xué)測定:11例符合入組標(biāo)準(zhǔn)并簽署知情同意書的健康志愿者按照 CES1A2不同基因型篩選分成兩組:CYP2C19均為 EM,一組為CES1A2 AA型(n=6例),一組為CES1A2 AC或CC型(n=5例),兩組均給予氯吡格雷300mg后

6、,分別于給藥前(0h)和給藥后0.25,0.5,0.75,1,1.25,1.5,2,3,4,5,6,8,12,24,36h采集血樣,用于藥代動力學(xué)(PK)研究;并于給藥前(0h)和給藥后1,2,4,12,24h采集血樣,用于藥效學(xué)(PD)研究。利用UPLC-MS/MS測定氯吡格雷及其非活性和活性代謝產(chǎn)物的濃度,利用非房室模型分析氯吡格雷原藥、活性及非活性代謝產(chǎn)物藥動學(xué)參數(shù);利用四通道血小板聚集儀測定的ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率,以血小板聚

7、集抑制的變化程度(IPA％)作為氯吡格雷藥效學(xué)指標(biāo)。
　　結(jié)果:
　　(1)基因型分布:86例人肝組織樣本中進(jìn)行 CYP2C19*2/*3和 CES1A2 A(-816)C基因測定:① CES1A2 A(-816)C基因分布:AA型43例(50.0％),AC型37例(41.86％),CC型6例(8.14％);
　?、?CYP2C19*2/*3基因表型分布:快速代謝型EM有37例(43.02％),中等代謝型有38例(44

8、.19％),弱代謝型有11例(12.79％);
　?、蹃喰头植?在37例CYP2C19EM的亞組中:CES1A2 A(-816)C AA型15例(40.54％),AC型16例(43.24％),CC型6例(16.22％);在38例CYP2C19 IM的中,AA型24例(63.16％),AC型14例(36.84％);在11例CYP2C19 PM中, AA型4例(36.36％),AC型7例(63.64％)。
　　(2)人肝微粒體孵

9、育體系與人血漿中氯吡格雷原藥、活性及非活性代謝產(chǎn)物濃度的方法學(xué):氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物在肝微粒體孵育體系中和人血漿中的線性范圍均為1~200ng·mL-1,且線性良好(R2分別為0.9977和0.9930);氯吡格雷非活性代謝產(chǎn)物在肝微粒體孵育體系中和人血漿中的線性范圍分別為10~2000ng·mL-1和25~10000ng·mL-1,且線性良好(R2分別為0.9964和0.9945);氯吡格雷原藥在血漿中的線性范圍為0.1~20ng·m

10、L-1,且線性良好(R2為0.9961),方法的批內(nèi)批間精密度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性等均符合生物樣本檢測要求。
　　(3)CES1A2不同基因型對人肝微粒體孵育體系中氯吡格雷非活性代謝產(chǎn)物生成酶動力學(xué)及活性代謝產(chǎn)物濃度的影響:
　?、?CES1-816CC基因型的Vmax是-816AA型的1.34倍(CC vs AA:635.20±12.06vs475.10±26.55pmol·min-1·mg·protein-1,P<

11、0.05),相應(yīng)的活性代謝產(chǎn)物水平在底物濃度為20、50μM時呈現(xiàn)出了降低趨勢(P>0.05)。
　?、诟鶕?jù)CYP2C19代謝表型分組后,在EM組中, CES1-816CC的Vmax是-816AA型的1.39倍(CC vs AA:669.80±20.72vs480.6±13.84pmol·min-1·mg·protein-1, P<0.05),相應(yīng)的氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物水平只有-816AA型的60％或更低。在IM中同樣觀察到了類似

12、的現(xiàn)象,但在PM組中,由于活性代謝產(chǎn)物生成量極低,并未觀察到類似的結(jié)果。
　　(4)CES1A2基因多態(tài)性對健康志愿者氯吡格雷藥代動力學(xué)影響:CES1A2-816AA組與CES1A2-816 AC/CC組相比,氯吡格雷AUC0-∞(15.6±4.8 vs9.7±1.7ng·mL-1·h-1),氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物AUC0-last、AUC0-∞(122.4±38.1 vs73.9±17.9ng·mL-1·h-1;124.2±37.

13、6vs76.4±17.71ng·mL-1·h-1),顯著升高(P<0.05);CCAM AUC0-last、AUC0-∞和Cmax(41368.46±12832.65 vs64346.12±13740.94ng·mL-1·h-1;42173.30±13382.47 vs65545.46±14166.2ng·mL-1·h-1;11050.06±3308.02vs20671.22±3469.58ng·mL-1)明顯降低(P<0.05)。

14、r>　　(5)CES1A2基因多態(tài)性對健康志愿者氯吡格雷藥效學(xué)影響:兩組基因型個體給藥前的血小板聚集率的基礎(chǔ)值均無差異(P>0.05)。CES1A2-816AA型個體服藥后2、4h測定的血小板聚集率變化程度顯著高于-816AC/CC個體(62.05士7.13％、82.91士6.96％vs47.25士9.44％、61.60士21.51％,P<0.05)。其相應(yīng)的平均效應(yīng)時間曲線下面積AUEC0-24-816AA型是AC/CC型的1.27倍