BBSV衛(wèi)星RNA及WYMV基因沉默抑制子功能的鑒定與分析.pdf

1、甜菜黑色焦枯病毒(BBSV)的衛(wèi)星RNA(sat-RNA)在受到感染的寄主植物莧色藜(Chenopodiumamaranticolor)體內(nèi)，能夠提高輔助病毒基因組RNA的復(fù)制與積累水平，造成接種葉片枯斑數(shù)目增加，并可能促進(jìn)輔助病毒BBSV的系統(tǒng)性侵染。為了認(rèn)識BBSV sat-RNA參與并增強(qiáng)輔助病毒致病性的本質(zhì)，本文利用重組DNA技術(shù)和轉(zhuǎn)gfp基因本生煙(Nicotiana benthamiana)作為模式植物，從基因沉默的角度對B

2、BSV sat-RNA與植物的相互作用開展了初步的研究。結(jié)果表明：(1)以馬鈴薯X病毒(PVX)侵染性克隆或雙元質(zhì)粒為載體，經(jīng)農(nóng)桿菌浸潤注射混合接種gfp轉(zhuǎn)基因本生煙以后，植株表型觀察、咖mRNA和蛋白表達(dá)、以及對相關(guān)siRNA的檢測結(jié)果表明，以反義鏈形式表達(dá)的sat-RNA能夠強(qiáng)烈抑制由同源gfp RNA引起的系統(tǒng)性基因沉默。與此對照，正向插入的sat-RNA對沉默的抑制則不明顯，即BBSV sat-RNA的正義鏈和反義鏈在抑制基因沉

3、默的過程中具有不同作用。(2)雖然在以往的研究結(jié)果中并沒有檢測到任何由BBSV sat-RNA編碼的蛋白質(zhì)，但為了排除。BBSV sat-RNA反義鏈可能存在的蛋白編碼能力，進(jìn)一步將計(jì)算機(jī)推導(dǎo)所得的可能編碼框進(jìn)行了突變滅活。接種試驗(yàn)結(jié)果表明，突變后的sat-RNA反義鏈并沒有喪失對基因沉默的抑制功能，說明這可能是一種RNA水平上的抑制作用。(3)使用gfp基因載體(沉默誘導(dǎo)子)和反義鏈sat-RNA載體(沉默抑制子)，在不同時(shí)間或不同部

4、位的葉片上對轉(zhuǎn)基因本生煙進(jìn)行接種，初步證明sat-RNA的作用可能是抑制了沉默信號的傳導(dǎo)。(4)另外，利用pVX病毒載體或雙元質(zhì)粒載體，分別攜帶咖基因或sat-RNA進(jìn)行的交叉組合接種不僅驗(yàn)證了BBSV反義sat-RNA的沉默抑制子功能，同時(shí)還顯示BBSV sat-RNA對基因沉默的抑制程度受到由載體類型所決定的、“沉默誘導(dǎo)子”與“沉默抑制子”二者之間相對表達(dá)強(qiáng)度的影響。即，在病毒因子抑制寄主基因沉默機(jī)制的過程中，劑量作用也在其中發(fā)揮著

5、重要作用。(5)反義鏈BBSV sat－RNA不僅具有抑制系統(tǒng)性基因沉默的功能，而且也能夠在一定程度上對局部接種葉的早期PTGS反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。 由于小麥黃花葉病毒(WYMV)的寄主范圍非常狹窄，難于機(jī)械接種，病毒粒子及RNA穩(wěn)定性極低，容易降解，且寄主植物小麥的遺傳操作又非常復(fù)雜等因素，目前尚無法利用反向遺傳學(xué)技術(shù)開展研究。為了在分子水平上逐步認(rèn)識WYMV與寄主植物的相互作用，并為進(jìn)一步的深入研究積累更多的材料，本論文還進(jìn)

6、行了以下探索性工作。首先，利用與上述相同的基因沉默試驗(yàn)體系，將WYMV的P3、CI、NIa、NIb、CP、P1和P2基因分別導(dǎo)入pVX載體，接種轉(zhuǎn)gfp基因本生煙后，篩選鑒定可能存在的沉默抑制因子。初步結(jié)果表明，WYMV RNA2的P1和CI蛋白可能具有抑制基因沉默的功能。同時(shí)，核苷酸突變試驗(yàn)結(jié)果顯示，P1蛋白的翻譯可能是起始于WYMVRNA2第202-204位核苷酸的ATG，并非以往由計(jì)算機(jī)推導(dǎo)的同相位上游ATG位點(diǎn)(172nt-17

7、4nt)，且P1蛋白對基因沉默具有抑制作用的功能域可能存在于P1蛋白氨基酸序列的中部。另外，為了獲得WYMV的菌傳功能缺陷突變株，在人工氣候箱內(nèi)的小麥上連續(xù)人工機(jī)械接種WYMV至41代。其中，隨著接種代次的提高，感病株率與防病嚴(yán)重程度明顯提高，說明wYMV的致病性得到增強(qiáng)。利用。RT-PCR方法，自第27代及此后的繼代接種感病小麥中檢測到了WYMV的RNA2內(nèi)部缺失自然突變株。缺失區(qū)域位于WYMV RNA2的214—2808 nt之間，