LSV 16kDa-TGB1抗血清制備及RNA沉默抑制子的鑒定.pdf

1、百合無癥病毒（Lily symptomless virus，LSV）是香石竹潛隱病毒屬（Carlavirus）中的一種，能夠嚴重危害百合種球質(zhì)量和鮮切花品質(zhì)，是侵染百合的三大病毒之一。病毒為單鏈正義RNA，含有6個開放閱讀框(ORF)，編碼4個蛋白，依5'至3'分別編碼:RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp），三基因連鎖運動蛋白(TGB1-3)，外殼蛋白(CP)和未知功能蛋白(16kDa)。
　　本研究以感染LSV的百合葉片為試材，

2、通過RT-PCR克隆LSV基因16kDa。將該基因連接至原核表達載體pET-28a(+)，重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導表達并通過SDS-PAGE及質(zhì)譜分析，證明得到高效表達的16kDa融合蛋白，蛋白以包涵體形式存在。經(jīng)鎳柱純化后得到純度較高的蛋白。將純化蛋白16kDa和TGB1分別作為抗原免疫小鼠，制備16kDa和TGB1蛋白抗血清，間接ELISA檢測抗血清效價較高。通過Western blot分析，制備的特異性

3、抗血清能與16kDa，TGB1以及百合葉片總蛋白反應，均出現(xiàn)目的雜交條帶。制備的抗血清可用于病毒檢測、蛋白質(zhì)印跡、免疫組織化學等方面的研究。
　　為了驗證LSV是否編碼RNA沉默抑制子來干擾植物RNA沉默，以16kDa和TGB1為研究對象，分別構(gòu)建TGB1、16kDa和16kDa△的pMDTM18-T載體，測序正確后連至雙元表達載體PTF101.1，將獲得的重組質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌共浸潤到轉(zhuǎn)GFP本氏煙16c。將TGB1、16kDa分別

4、構(gòu)建至雙元表達載體pGR107，侵染普通本氏煙。結(jié)果表明:16kDa蛋白能抑制由GFP介導的局部沉默和系統(tǒng)沉默，其抑制作用較弱;能逆轉(zhuǎn)系統(tǒng)沉默;不能抑制由dsRNA引起的局部沉默;TGB1蛋白無抑制沉默功能。實時定量PCR和Western blot也證明了上述結(jié)果，即16kDa是LSV編碼的RNA沉默抑制子。另外，TGB1和16kDa均不能加重PVX病毒的癥狀，證明有些抑制子不會與PVX病毒協(xié)同作用。
　　將含有PTF101-16

5、kDa/TGB1質(zhì)粒的農(nóng)桿菌分別侵染煙草和百合，提取煙草和百合線粒體的總蛋白，Western blot檢測證明16kDa和TGB1都位于線粒體上。免疫膠體金電鏡觀察發(fā)現(xiàn)16kDa和TGB1金顆粒在葉綠體中，但含量極少。以上結(jié)果表明:16kDa和TGB1主要作用于細胞線粒體中，對葉綠體影響有限。
　　綜上所述，本研究通過LSV編碼蛋白TGB1和16kDa功能分析，初步判定16kDa蛋白具有RNA沉默抑制子功能。16kDa和TGB1主