卡巴膽堿干預(yù)大鼠腹腔粘連的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 1.研究膽堿能受體激動劑卡巴膽堿對大鼠腹腔粘連形成的干預(yù)作用；
　　 2.研究卡巴膽堿對粘連組織微血管生成和微血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響及其與膽堿能抗炎通路的關(guān)系。
　　 方法：分動物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩部分
　　 1.動物實(shí)驗(yàn):采用健康雄性60-70日齡Wistar大鼠，體重(200～220)g，完全隨機(jī)法分為8組：①假手術(shù)組(S組，n=8)，開腹后不做任何處理；②腹腔粘連組(A組，n=1

2、4)，行腹腔粘連手術(shù)；③卡巴膽堿處理組(C組，n=14)，腹腔粘連術(shù)后腹腔注射卡巴膽堿(60μg/kg.ml)；④煙堿處理組(N組，n=14)，腹腔粘連術(shù)后腹腔注射煙堿(1mg/kg.ml)；⑤生理鹽水組(NS組，n=8)，腹腔粘連術(shù)后腹腔注射生理鹽水(1ml/kg)；⑥α-銀環(huán)蛇毒素組(α組，n=12)，腹腔粘連術(shù)后腹腔注射α-銀環(huán)蛇毒素(1μg/kg.ml)；⑦卡巴膽堿+α-銀環(huán)蛇毒素組(C/α組，n=12)，腹腔粘連術(shù)后腹腔注射α

3、-銀環(huán)蛇毒素(1μg/kg.ml)，15分鐘后腹腔注射卡巴膽堿(60μg/kg.ml)；⑧煙堿+α-銀環(huán)蛇毒素組(N/α組，n=12)，腹腔粘連術(shù)后腹腔注射α-銀環(huán)蛇毒素(1μg/kg.ml)，15分鐘后腹腔注射煙堿(1mg/kg.ml)。采用無菌干紗布摩擦大鼠盲腸蚓突末端復(fù)合左側(cè)腹壁縫合固定硅膠膜法制作大鼠腹腔粘連動物模型，于術(shù)畢即刻、術(shù)后24小時、48小時腹腔局部注射藥物，術(shù)后第10天處死大鼠。用Chiang分類法評估大鼠大體腹腔粘

4、連程度。取粘連組織切片行HE染色觀察粘連組織病理變化及微血管增生情況，免疫組織化學(xué)法檢測粘連組織VEGF表達(dá)，并進(jìn)行圖像分析。
　　 2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):采用組織塊法培養(yǎng)Wistar大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為7組：①TNF-α組(T組)：TNF-α終濃度為10ng/ml；②卡巴膽堿+TNF-α組(C組，分5個亞組，卡巴膽堿終濃度分別為2mmol/1(C1組)、0.2mmol/1(C2組)、0.02mmol/1(C3組)、2μmol

5、/1(C4組)、0.2μmol/1(C5組)，TNF-α終濃度為10ng/ml)；③煙堿+TNF-α組，(N組，煙堿終濃度為0.2mmol/1，TNF-α終濃度為10nglml)；④α-銀環(huán)蛇毒素+TNF-α組，(α組，α-銀環(huán)蛇毒素終濃度為6μg/ml，TNF-α終濃度為10ng/ml)；⑤α-銀環(huán)蛇毒素+卡巴膽堿(C2)+TNF-α組，(C2/α組，α-銀環(huán)蛇毒素終濃度為6μg/ml，卡巴膽堿終濃度為0.2mmol/1，TNF-α終

6、濃度為10ng/ml)；⑥α-銀環(huán)蛇毒素+煙堿組+TNF-α，(N/α組，α-銀環(huán)蛇毒素終濃度為6μg/ml，煙堿終濃度為0.2mmol/1，TNF-α終濃度為10ng/ml)；⑦單純細(xì)胞組(B組)，只加細(xì)胞和培養(yǎng)液，不加其它試劑。通過倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、CD31和VIII因子免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定。MTT法檢測大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況。ELISA法檢測肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的生成。
　　 結(jié)果：
　　

7、 1.假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)腹腔粘連，腹腔粘連組14只大鼠均出現(xiàn)了腹腔粘連，粘連評分區(qū)間為6-12分，說明摩擦大鼠盲腸蚓突末端復(fù)合左側(cè)腹壁縫合固定硅膠膜法可成功制作大鼠腹腔粘連動物模型。
　　 2.倒置相差顯微鏡下觀察見培養(yǎng)細(xì)胞呈梭形，鋪路石樣排列，單層貼壁生長，CD31和VIII因子免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽性反應(yīng)，說明培養(yǎng)細(xì)胞為肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 3.與腹腔粘連組比較，經(jīng)卡巴膽堿和煙堿處理后，大鼠腹腔粘程度明顯減輕，粘

8、連組織微血管生成及VEGF表達(dá)減少；用α-銀環(huán)蛇毒素阻斷α7nAchR后，卡巴膽堿、煙堿抑制腹腔粘連的作用明顯減輕。
　　 4.卡巴膽堿、煙堿能抑制TNF-α刺激后大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及VEGF生成，阻斷微血管內(nèi)皮細(xì)胞α7nAchR能顯著減輕擬膽堿藥的作用。
　　 結(jié)論：卡巴膽堿能明顯減輕大鼠腹腔粘連程度；其機(jī)制可能與其興奮α7nAChR，下調(diào)粘連組織中促炎因子水平、抑制粘連組織微血管生成和微血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)