卡巴膽堿對(duì)脂多糖刺激大鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因子的影響及其受體研究.pdf

1、目的： 1.觀察卡巴膽堿對(duì)脂多糖刺激大鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因子的影響； 2．研究卡巴膽堿抑制脂多糖刺激大鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子的受體途徑，為卡巴膽堿用于膿毒癥和多器官功能障礙等過(guò)度炎癥性疾病的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：采用脂多糖(LPS，100ng/mL)刺激大鼠腹腔巨噬細(xì)胞模型，用酶聯(lián)免疫吸．附法(ELISA)和免疫熒光法進(jìn)行研究。 1．卡巴膽堿對(duì)LPS刺激巨噬細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因子的影響以

2、及和其他膽堿能受體激動(dòng)劑作用的比較取雄性Wistar大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，調(diào)整濃度為10<'6>細(xì)胞/mL，加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。分別加入卡巴膽堿(K1 2mmol/U、K2 0.2mmol/L、K3 0.02mmol/L、K4 2 μmol/L、K5 0.2 μmol/L、K6 0.02 μmol/L 6種濃度)、N樣膽堿能受體激動(dòng)劑煙堿(nicotine)或M樣膽堿能受體激動(dòng)劑毒蕈堿(muscarine)，室溫下處理15min；然后各

3、孔加入LPS，置于37℃、5％CO<,2>細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4h。檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和抑炎細(xì)胞因子IL-10的濃度。實(shí)驗(yàn)分為5組：①空白對(duì)照組C；②LPS對(duì)照組，L；③卡巴膽堿組，K；④煙堿組，N；⑤毒蕈堿組，M。其中K組用6種不同濃度卡巴膽堿(K1-K6)觀察其作用的差異并確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中膽堿能受體激動(dòng)劑的濃度。 2．卡巴膽堿抑制LPS刺激巨噬細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子的受體途徑取上述濃度巨噬細(xì)胞置于2

4、4孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入M樣膽堿能受體拮抗劑阿托品或N樣膽堿能受體α7亞基(α7nAChR)特異性拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素(α-Bgt)，室溫下孵育15min；后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同第一部分。檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6的濃度。實(shí)驗(yàn)分為6組：①卡巴膽堿組，K；②煙堿組，N；③阿托品+卡巴膽堿組，AK；④阿托品+煙堿組，AN；⑤銀環(huán)蛇毒素+卡巴膽堿組，BK：⑥銀環(huán)蛇毒素+煙堿組，BN。免疫熒光法實(shí)驗(yàn)取上述濃度細(xì)胞，在6孔培養(yǎng)板中制作細(xì)胞爬片

5、。先用卡巴膽堿或煙堿(5mmol/L)處理15min，再加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的α-Bgt(30 μg/mL)，4℃孵育15min。 沖洗、封片后，在熒光顯微鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度并攝片。實(shí)驗(yàn)分為4組：①陰性對(duì)照組；②陽(yáng)性對(duì)照組：?jiǎn)渭冇肍ITC-α-Bgt標(biāo)記細(xì)胞：③煙堿對(duì)照組：煙堿+FITC-α-Bgt；④卡巴膽堿組：卡巴膽堿+FITC-α-Bgt。 結(jié)論： 1、卡巴膽堿能顯著抑制L