埃他卡林對腦缺血損傷的保護作用及其藥理學(xué)特征的研究.pdf

1、腦血管病是常見病、多發(fā)病，死亡率與致殘率很高，嚴重威脅人類生命健康，主要包括出血性和缺血性腦血管疾病兩大類，尤以后者更嚴重。缺血性腦血管疾病發(fā)病機理復(fù)雜，目前尚未完全闡明，迄今為止尚無理想的治療缺血性腦損傷的有效藥物，開發(fā)和研制治療缺血性腦損傷的新型藥物顯得十分緊迫和必要。 ATP敏感性鉀通道(ATPsensitivepotassiumchannel，KATP)首先發(fā)現(xiàn)存在于心肌細胞，是急性心肌缺血的重要治療靶點，KATP開放劑

2、(KATPopener,KCO)在心肌缺血模型上具有保護作用。在腦組織中對缺血非常敏感的海馬、蒼白球、黑質(zhì)、紋狀體和皮層等腦區(qū)的神經(jīng)元富含KATP，動物實驗證明KCO具有神經(jīng)元保護作用，提示KATP在缺血性腦損傷的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的內(nèi)在保護作用，對KCO的研究為尋找新型神經(jīng)元保護劑開辟了新的思路。 埃他卡林(iptakalim，Ipt)是具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的新結(jié)構(gòu)類型ATP敏感性鉀通道開放劑。本研究室以往的結(jié)果表明埃他卡林

3、對沙土鼠全腦缺血損傷有明顯的保護作用，在鹽負荷致卒中型自發(fā)性高血壓大鼠上發(fā)現(xiàn)埃他卡林具有確切的防治腦卒中作用。為了進一步完善埃他卡林抗腦缺血損傷作用的藥效學(xué)資料，同時探討其藥理學(xué)特征，在本文研究工作中，我們在以往系列工作基礎(chǔ)上，選擇被普遍認為是局灶性腦缺血的標準動物模型—線栓法阻斷大鼠大腦中動脈(MCAO)致持久性局灶性腦缺血模型、局灶性腦缺血再灌注模型以及小鼠斷頭致全腦缺血缺氧模型，從“行為學(xué)—病理學(xué)—血液流變學(xué)—分子生物學(xué)”等多層次

4、系統(tǒng)研究Ipt對缺血性腦損傷的實驗治療作用及其藥理學(xué)特征，為Ipt發(fā)展為新型治療腦缺血損傷的藥物提供實驗依據(jù)。 一.埃他卡林抗腦缺血損傷作用的研究1.埃他卡林對大鼠持久性局灶性腦缺血損傷的保護作用在大鼠持久性局灶性腦缺血模型上，觀察埃他卡林對腦缺血損傷的保護作用。線栓法阻斷SD大鼠大腦中動脈造成大鼠局灶性腦缺血，腦缺血6h后進行檢測，神經(jīng)功能行為學(xué)評分參考Longa法，腦水腫形成檢測采用Ellis公式，TTC染色法測定腦梗死范圍

5、。預(yù)防性給藥時間為麻醉后MCAO手術(shù)前30min，治療性給藥時間分別為MCAO術(shù)后0.5h,2.0h,3.0h,4.0h。 以上結(jié)果說明埃他卡林對持久性局灶性腦缺血引起的腦損傷有保護作用。 2.埃他卡林對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用在大鼠局灶性腦缺血再灌注模型上，觀察埃他卡林對急性腦缺血再灌注損傷的保護作用，神經(jīng)功能行為學(xué)評分及腦梗死范圍測定方法同上。 結(jié)果顯示：大鼠局灶性腦缺血60min再灌注1d、3d

6、及7d后，出現(xiàn)明顯的神經(jīng)病學(xué)癥狀，神經(jīng)功能行為評分7d時最低為(1.7±1.3)；腦梗死范圍分別為(23.14±2.4)％、(22.4±2.6)％、(21.74±2.8)％。再灌注前腹腔注射Ipt4.0mg·kg-1，以后1次/日治療后大鼠神經(jīng)功能行為顯著改善，腦梗死范圍明顯縮小。 以上結(jié)果說明埃他卡林對局灶性腦缺血再灌注損傷具有保護作用。 3.埃他卡林對小鼠腦缺血損傷的保護作用在小鼠全腦缺血模型上觀察Ipt對小鼠腦缺血

7、損傷的保護作用。小鼠全腦缺血模型采用斷頭制備，紅細胞膜脂流動性采用熒光偏振法測定，腦組織中MDA含量，GSH-PX活性及SOD活性采用化學(xué)比色法測定。 說明埃他卡林對小鼠全腦缺血損傷有顯著保護作用，其作用與維生素E不同，與抗氧化作用無關(guān)。 二.埃他卡林抗腦缺血損傷作用的藥理學(xué)特征的研究1.埃他卡林抗腦缺血損傷作用與ATP敏感性鉀通道的關(guān)系在小鼠斷頭致全腦缺血模型上觀察格列苯脲對埃他卡林抗腦缺血損傷作用的影響，比較埃他卡林

8、、尼莫地平及吡那地爾的作用特點。 結(jié)果顯示：Ipt(2.0mg·kg-1ig，3wk)可顯著延長小鼠斷頭后喘息作用時間，顯著增加紅細胞膜脂流動性、降低微粘度，同樣條件下，Gli(50mg·kg-1ig，3wk)對小鼠斷頭后喘息作用時間、紅細胞膜流動性及微粘度無影響，但它可以拮抗埃他卡林的作用。Nim及Pin(均為2.0mg·kg-1ig，3wk)也可顯著延長小鼠斷頭后喘息作用時間，顯著增加紅細胞膜脂流動性、降低微粘度。Nim還能

9、夠降低小鼠腦組織中MDA含量，提高GSH-PX及SOD活性，Ipt及Pin的這一作用不顯著。 以上結(jié)果說明埃他卡林對小鼠腦組織缺血的保護作用與尼莫地平不同與KATP有關(guān)。 2.局灶性腦缺血時KATP基因表達的變化以及埃他卡林的作用觀察Ipt對持久性局灶性腦缺血大鼠腦組織內(nèi)Kir6.x表達變化的影響，探討Ipt對大鼠持久性局灶性腦缺血損傷保護作用的分子機制。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對大鼠腦組織中Kir6.1及Kir6.2mRN

10、A表達進行檢測。 結(jié)果顯示：與假手術(shù)對照組比較，持久性局灶性腦缺血后，缺血模型組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)運動功能障礙，大鼠腦組織中Kir6.2mRNA表達明顯上調(diào)，Kir6.1mRNA的表達有增加趨勢，但與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。預(yù)防性給予Ipt(1.0，2.0，4.0mg·kg-1ip)大鼠神經(jīng)功能受損程度顯著改善，同時與缺血模型組比較Kir6.2mRNA的表達顯著提高，且呈良好的線性關(guān)系。相同條件下，Nim組也可顯著改善大鼠神經(jīng)

11、功能受損程度，但對Kir6.2mRNA表達無顯著作用。 說明埃他卡林抗腦缺血損傷作用機制與尼莫地平不同，與KATP有關(guān)。 3.局灶性腦缺血時神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白的變化以及埃他卡林的作用采用普通病理蘇木素—曙紅(haematoxylin&eosin,HE)染色評價Ipt對大鼠持久性局灶性腦缺血損傷的組織學(xué)保護作用，采用免疫組織化學(xué)檢測腦神經(jīng)元中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2及caspase-3的表達，研究Ipt對在體腦缺血及

12、腦缺血再灌注模型中腦組織神經(jīng)元細胞凋亡的影響，探討Ipt抗腦缺血損傷作用的藥理學(xué)特征。 結(jié)果顯示：MCAO術(shù)后6h，缺血模型組大鼠腦病理切片顯示大量神經(jīng)元周圍間隙擴大，出現(xiàn)散在的暗染神經(jīng)元，神經(jīng)細胞出現(xiàn)不同程度的皺縮、染色質(zhì)凝聚等缺血病理改變。假手術(shù)組未見明顯的病理改變，Ipt4.0mg·kg-1ip或Nim0.3mg·kg-1ip預(yù)防合并治療后上述癥狀有所減輕。MCAO術(shù)后6h缺血模型組大鼠腦組織中Bax及Bcl-2表達較假手

13、術(shù)組增強、數(shù)目增多，Bcl-2/Bax顯著下降。Ipt及Nim能降低Bax的表達、提高Bcl-2的表達，從而提高了Bcl-2/Bax，其中埃他卡林的治療作用顯著。大鼠局灶性腦缺血60min再灌注3d后腦神經(jīng)元caspase-3的表達明顯增強，Ipt治療后表達顯著降低，說明Ipt對局灶性腦缺血及局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞凋亡有抑制作用，其作用機制與Bax、Bcl-2及caspase-3的表達有關(guān)。 4.局灶性腦缺血時血液流變

14、學(xué)的變化以及埃他卡林的作用線栓法阻斷SD大鼠大腦中動脈造成大鼠局灶性腦缺血，局灶性腦缺血6h后檢測血液流變學(xué)指標。采用熒光偏振法測定紅細胞膜脂流動性、微粘度，紅細胞變形能力及紅細胞聚集程度用紅細胞聚集/變形儀測定。 三.埃他卡林衍生物對谷氨酸所致PC12細胞損傷作用的影響體外培養(yǎng)PC12細胞，研究埃他卡林衍生物對谷氨酸所致PC12細胞損傷作用的影響。谷氨酸損傷后PC12細胞數(shù)量及其突起顯著減少和消失，OD值明顯降低。十種衍生物中

15、，當一側(cè)取代基為碳原子數(shù)3-5個的烷烴，或被具有共軛系統(tǒng)的苯酚及雜環(huán)化合物取代時，該類衍生物對谷氨酸所致PC12細胞損傷具有顯著的保護作用，當一側(cè)取代基為碳原子數(shù)1-2個的烷烴，或被苯環(huán)取代時，該類衍生物對谷氨酸所致PC12細胞損傷無保護作用甚至?xí)a(chǎn)生加重損傷作用。表明具有特定取代基團的埃他卡林衍生物才具有保護神經(jīng)元缺血缺氧損傷的作用。 四.結(jié)語1.在持久性局灶性腦缺血、局灶性腦缺血再灌注和全腦缺血損傷的實驗?zāi)Ｐ蜕?，埃他卡林具?/p>

16、抗腦缺血損傷的作用，使缺血條件下腦水腫減輕，腦梗死面積縮小，改善神經(jīng)功能行為缺陷。 2.埃他卡林不僅具有預(yù)防腦缺血損傷的作用，而且具有治療腦缺血損傷的作用。在腦缺血3小時之內(nèi)，埃他卡林對缺血導(dǎo)致的腦梗死和神經(jīng)功能行為缺陷有治療作用。 3.埃他卡林抗腦缺血損傷作用與其激活神經(jīng)元ATP敏感性鉀離子通道(KATP)相關(guān)。選擇性KATP拮抗劑格列苯脲可對抗埃他卡林的抗腦缺血損傷的作用；局灶性腦缺血時，Kir6.2基因表達上調(diào)，預(yù)

17、防性給予埃他卡林可以顯著增加Kir6.2基因表達的上行性調(diào)節(jié)。 4.埃他卡林可降低缺血時腦神經(jīng)細胞Bax的蛋白表達，增加Bcl-2的蛋白表達，逆轉(zhuǎn)Bcl-2和Bax蛋白表達比例的病理性改變；減少caspase-3的過度表達，從而對抗缺血以及缺血再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡，介導(dǎo)神經(jīng)保護效應(yīng)。 5.埃他卡林可以提高紅細胞膜脂流動性、降低微粘度；預(yù)防性給藥可以改善腦缺血損傷時的紅細胞變形能力，增加紅細胞膜脂流動性，降低紅細胞聚