抑癌基因Apaf-1和APC在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及啟動子甲基化狀況的研究.pdf

1、膀胱癌是泌尿外科最常見的惡性腫瘤，具有早期診斷困難，治療后容易復(fù)發(fā)的特點。盡管外科治療和化療方法不斷進(jìn)步，但治療效果仍不十分滿意，且其術(shù)后的輔助治療和長期隨訪也增加了患者的醫(yī)療費用和痛苦。因此，探索膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制和遺傳學(xué)本質(zhì)，為膀胱癌的早期診斷及靶向性治療提供理論基礎(chǔ)，是臨床和科研上急需解決的重要課題。與其他惡性腫瘤一樣，膀胱癌的發(fā)生是多基因、多階段變異累積形成的病理過程。這些基因主要是癌基因、抑癌基因及錯配修復(fù)基因等

2、。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，原癌基因的激活和抑癌基因的失活導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控及凋亡缺陷被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的主要機(jī)制。抑癌基因功能的丟失可以通過多種途徑，DNA甲基化是除缺失和突變之外導(dǎo)致抑癌基因失活的第三種機(jī)制，異常甲基化可引起染色體結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性的改變和基因表達(dá)異常，影響細(xì)胞的增殖和分化，最終導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)沉默。因此，DNA甲基化被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵事件，在腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。 Apaf-1

3、(細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子-1)、APC(腺瘤性結(jié)腸息肉病相關(guān)基因)是兩種重要的抑癌基因，分別在細(xì)胞凋亡和Wnt信號傳導(dǎo)通路調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。新近研究證實Apaf-1、APC在許多正常組織中均有表達(dá)，但是在胃癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤中卻出現(xiàn)表達(dá)缺失。有關(guān)Apaf-1、APC基因的表達(dá)和啟動子甲基化狀況在泌尿系腫瘤的研究報道較少，本實驗擬通過SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法檢測膀胱移行細(xì)胞癌(BTCC)組織中Apaf-1和AP

4、C的啟動子甲基化狀態(tài)，用免疫組織化學(xué)的方法回顧性分析膀胱移行細(xì)胞癌中Apaf-1和APC的蛋白表達(dá)，并分析兩種抑癌基因的啟動子甲基化狀態(tài)和蛋白表達(dá)與膀胱癌臨床生物學(xué)行為的關(guān)系，探討膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，為臨床早期診斷和預(yù)后判斷提供依據(jù)，并為膀胱癌的分子治療提供新的靶點。 第一部分抑癌基因Apaf-1及APC在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義 目的：探討抑癌基因Apaf-1和APC在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義。

5、 方法：收集2001年1月至2003年12月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科確診為膀胱移行細(xì)胞癌患者的臨床資料和石蠟組織標(biāo)本80例，采用免疫組織化學(xué)法分析Apaf-1及APC在膀胱移行細(xì)胞癌組織標(biāo)本中的蛋白表達(dá)狀況及其表達(dá)與患者的臨床病理及生存期之間的關(guān)系。以15例正常膀胱組織的石蠟標(biāo)本作對照。 免疫組化染色結(jié)果判定：Apaf-1、APC的表達(dá)以染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率的得分之和進(jìn)行判斷：(1)染色強(qiáng)度：陰性為0分；弱陽性為

6、1分；陽性為2分；強(qiáng)陽性為3分。(2)每個標(biāo)本觀察3個有代表性的高倍視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，確定陽性細(xì)胞數(shù)所占的百分比并取它們的平均值，根據(jù)陽性細(xì)胞比例，分為陽性細(xì)胞0％為0分；<25％為1分；25％～50％為2分；>50％為3分。(1)+(2)之和等于0～3分為不表達(dá)或低表達(dá)組，4～6分為高表達(dá)組。 結(jié)果：Apaf-1在BTCC組織和正常膀胱組織中的蛋白陽性表達(dá)率分別為36.3％(29/80)和80.0％(12/15)

7、，差異分別有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.856，P=0.002)。APC在BTCC組織和正常膀胱組織中的蛋白表達(dá)率分別為47.5％(38/80)和93.3％(14/15)，差異分別有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.71，P=0.001)。Apaf-1、APC蛋白表達(dá)率均與臨床分級、分期明顯相關(guān)，隨腫瘤分級、分期的增加而降低，差異分別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而Apaf-1、APC蛋白表達(dá)率在不同性別、不同年齡、腫瘤單發(fā)與多發(fā)及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的

8、比較，差異均分別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。但在復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組的比較中，Apaf-1的蛋白表達(dá)率分別為20.6％(7/34)和47.8％(22/46)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=6.276，P=0.012)，而APC的蛋白表達(dá)率分別為52.9％(18/34)和43.5％(20/46)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(x2=0.702，P=0.402)。Kaplan—Meier分析顯示，Apaf-1不表達(dá)或低表達(dá)組患者的平均生存時間為48.70±1.

9、58個月，中位生存時間46.5個月；高表達(dá)組為67.54±4.09個月，中位生存時間67.3個月，經(jīng)log—rank生存曲線檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=21.18，P=0.000)。兩組5年總生存率分別為38.7％(24/62)和72.2％(13/18)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=6.302，P=0.012)。Kaplan—Meier分析顯示，APC不表達(dá)或低表達(dá)組患者的平均生存時間為51.4±1.8個月，中位生存時間50.0個月；高表

10、達(dá)組為65.6±2.9個月，中位生存時間68.4個月，log—rank生存曲線檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=19.29，P=0.000)。兩組5年總生存率分別為40.0％(22/55)和68.0％(17/25)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=5.39，P=0.020)。生存分析表明Apaf-1、APC基因的高表達(dá)組5年生存率高，有顯著的生存優(yōu)勢(P<0.05)。 結(jié)論： Apaf-1及APC在膀胱移行細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平明顯降低且與

11、臨床分級、分期相關(guān)，提示Apaf-1及APC基因的表達(dá)改變在BTCC的發(fā)生、發(fā)展中可能具有重要作用。 第二部分 DNA甲基化修飾及SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR技術(shù)平臺的建立 目的：建立SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR技術(shù)平臺，為下一步實驗做準(zhǔn)備。 方法：用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒從新鮮膀胱癌組織中提取DNA，用亞硫酸氫鹽進(jìn)行甲基化修飾后純化、回收。建立標(biāo)準(zhǔn)品，倍比稀

12、釋Apaf-1、APC的標(biāo)準(zhǔn)品，以Apaf-1、APC的甲基化和非甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增，建立PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢驗標(biāo)準(zhǔn)曲線的靈敏性和特異性。 結(jié)果：構(gòu)建的Apaf-1及APC標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好(擴(kuò)增反應(yīng)Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品模板起始濃度的對數(shù)呈較好的線性關(guān)系)。Apaf-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為—3.723，R2=0.999，PCR擴(kuò)增效率為1.021。APC的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為—3.3000，R2=1.000，PCR擴(kuò)增效率為1.009，靈敏度好

13、，特異性強(qiáng)，達(dá)到實驗要求。 結(jié)論： SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR技術(shù)平臺建立成功，可用于下一步BTCC組織中Apaf—Ⅰ及APC啟動子甲基化狀況的樣品檢測實驗。 第三部分膀胱移行細(xì)胞癌組織中Apaf-1及APC啟動子甲基化狀況及臨床意義 目的：定量檢測Apaf-1及APC在BTCC中的啟動子甲基化水平，分析其水平與BTCC臨床生物學(xué)行為的關(guān)系，探討膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。 方法：收集2006年

14、7月至2008年12月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科行手術(shù)治療，術(shù)后病理證實為BTCC患者的組織標(biāo)本36例，分別從36例新鮮膀胱癌組織及15例新鮮正常膀胱組織中提取DNA，經(jīng)亞硫酸氫鹽進(jìn)行甲基化修飾后純化、回收。確定Apaf-1及APC的反應(yīng)體系及條件，進(jìn)行SYBR GreenⅠ實時熒光定量的擴(kuò)增和檢測。每個樣本重復(fù)3次，根據(jù)CT值及樣品上樣量計算每納克(ng)DNA中Apaf-1及APC的甲基化拷貝數(shù)，析其啟動子甲基化量與患者臨床資料

15、之間的關(guān)系。 結(jié)果：Apaf-1在膀胱癌組織和正常膀胱組織中的甲基化率分別為100％(36/36)和6.77％(1/15)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=46.31，P=0.000)。APC在膀胱癌組織和正常膀胱組織中的甲基化率分別為69.44％(25/36)和33.33％(5/15)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=5.700，P=0.017)。Apaf-1及APC的甲基化量與膀胱癌的分化程度及臨床分期有明顯的相關(guān)性，隨腫瘤分級、分期的增加

16、而增加，差異分別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而Apaf-1及APC的甲基化量在不同性別、不同年齡以及腫瘤單發(fā)與多發(fā)之間的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Apaf-1的甲基化量在初發(fā)與復(fù)發(fā)的患者之間分別為(9.02±2.80)x103 copies/ng和(11.60±3.71)x103 copies/ng，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.026)，而APC的甲基化量在初發(fā)與復(fù)發(fā)的患者之間分別(2.55±2.05)x103 copies