杜仲葉黃酮苷元制備、與蛋白相互作用及免疫活性研究.pdf

1、我國(guó)杜仲資源非常豐富，而杜仲葉中富含黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、木脂素類(lèi)和苯丙素類(lèi)等活性化合物。近年研究表明，黃酮苷元的效價(jià)比黃酮苷要高，因此杜仲黃酮苷元具有極高的開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值。本文以杜仲葉為原料，在建立快速檢測(cè)杜仲黃酮苷元方法的基礎(chǔ)上；優(yōu)化了杜仲黃酮苷元的制備工藝；考察了杜仲中常見(jiàn)的五種黃酮類(lèi)化合物與牛血清白蛋白的作用機(jī)理，并初步探討不同純度杜仲黃酮的免疫活性。相關(guān)研究?jī)?nèi)容如下：
　?。?）建立了杜仲黃酮苷元的快速檢測(cè)方法，并對(duì)水解前

2、后杜仲葉和杜仲素中黃酮苷元含量進(jìn)行了測(cè)定。通過(guò)優(yōu)化，得到同時(shí)測(cè)定杜仲黃酮苷元的高效液相色譜條件為：色譜柱：Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.2％磷酸水溶液（63∶37）；檢測(cè)波長(zhǎng)：370nm；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y=41375X-76112，R=0.9997，檢測(cè)范圍為0.5~80μg/mL；山奈酚標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y=9694.9X-676

3、84，R=0.9996，檢測(cè)范圍為0.5~18μg/mL。方法學(xué)考察結(jié)果表明，該法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加標(biāo)回收率良好。樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，杜仲葉中槲皮素含量為0.021%，山奈酚含量是0.005%；通過(guò)酸水解，杜仲葉黃酮苷元含量提高20倍，杜仲素提高約7倍。
　?。?）優(yōu)化了制備杜仲黃酮苷元的水解工藝，并對(duì)苷元的富集工藝進(jìn)行了研究。采用濃度6 mol/L的鹽酸進(jìn)行水解，料液比為2∶1（mg/mL），水解溫度80℃，水解時(shí)間3 h

4、。該條件下，所得黃酮苷元的含量可達(dá)2.512%。將水解樣品采用聚酰胺兩步法富集杜仲黃酮苷元，即減壓濃縮、脫酸處理后，經(jīng)聚酰胺一步富集，黃酮苷元含量達(dá)到12.87%，再干法上樣，經(jīng)聚酰胺兩步富集后，杜仲黃酮苷元含量可達(dá)63.19%。進(jìn)一步柱層析純化，得到純度為85.27%的槲皮素。
　　（3）在模擬人體生理?xiàng)l件下，采用簡(jiǎn)便易行的光譜學(xué)手段，系統(tǒng)的研究了在杜仲中五種常見(jiàn)的黃酮類(lèi)化合物與牛血清白蛋白的相互作用，并考察了金屬離子Cu2+、

5、Zn2+、Pb2+、Fe3+和Mn2+對(duì)體系產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)牛血清白蛋白的猝滅均屬于靜態(tài)猝滅。結(jié)合常數(shù)的大小依次為山奈酚>槲皮素>蘆丁>槲皮苷>紫云英苷，并且均能夠形成一個(gè)高親結(jié)合位點(diǎn)。熱力學(xué)參數(shù)表明，各體系的結(jié)合過(guò)程中主要作用力類(lèi)型為疏水作用力、范德華力和氫鍵?！鱃<0表明各體系均屬于自發(fā)反應(yīng)。根據(jù) Frest能量轉(zhuǎn)移理論，這五種黃酮類(lèi)小分子與牛血清白蛋白之間發(fā)生非輻射能量傳遞；結(jié)合距離的大小為蘆丁>槲皮苷>紫云英苷

6、>山奈酚>槲皮素。紫外-可見(jiàn)吸收光譜、同步熒光光譜及三維熒光光譜等結(jié)果表明這些猝滅劑與牛血清白蛋白相互作用時(shí)，會(huì)導(dǎo)致肽鏈結(jié)構(gòu)和氨基酸殘基附近的微環(huán)境會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。金屬離子的存在不會(huì)改變猝滅類(lèi)型、結(jié)合位點(diǎn)，但是對(duì)結(jié)合常數(shù)、結(jié)合距離及作用力類(lèi)型會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響。
　?。?）利用 MTT法和酶聯(lián)免疫吸附法，通過(guò)考察不同純度的杜仲黃酮對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ誘生作用的影響，初步探討杜仲黃酮的免疫活性。結(jié)果