養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒合劑對(duì)慢傳輸型便秘的治療作用及機(jī)理研究.pdf

1、便秘是一種臨床常見疾病，同時(shí)也是多種疾病的一種臨床癥狀，其病因復(fù)雜，跨越多個(gè)學(xué)科。由于飲食結(jié)構(gòu)改變和精神心理社會(huì)因素影響，便秘的發(fā)病率逐年增高。有調(diào)查顯示我國(guó)慢性便秘的發(fā)病率為6.07％，在老年人群甚至可達(dá)到15％～20％。長(zhǎng)期的慢性便秘不僅給患者帶來許多苦惱，而且還在結(jié)腸癌、肝性腦病、乳腺疾病、早老性癡呆等病的發(fā)病中起著推波助瀾的作用。便秘甚至可以因誘發(fā)急性心梗或腦血管意外而直接危及患者生命。因此如何有效治療便秘，減少長(zhǎng)期便秘患者的苦

2、惱，降低由便秘引發(fā)的惡性事件的發(fā)生率成為廣大醫(yī)務(wù)工作者的重要任務(wù)。
　　 在各型便秘中，慢傳輸型便秘占有近一半的發(fā)生率(約45％)。近年來，慢傳輸型便秘的診療有了一定的突破，但較之西醫(yī)藥，中醫(yī)藥在防治慢傳輸型便秘方面更顯示出療效確切、副作用小等突出優(yōu)勢(shì)，而且關(guān)于慢傳輸型便秘的中醫(yī)藥研究取得了可喜的成績(jī)。
　　 中藥復(fù)方養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒是導(dǎo)師田振國(guó)教授立足于中醫(yī)中藥，博覽古今文獻(xiàn)，經(jīng)多年潛心研究，在大量的臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上總結(jié)出的經(jīng)

3、驗(yàn)方，主要用于治療慢傳輸型便秘。對(duì)中醫(yī)辨證屬于氣血津液虧虛的虛性便秘患者，具有滋陰養(yǎng)血，補(bǔ)氣助氣，潤(rùn)腸通便之功效，可通過調(diào)肝理脾、補(bǔ)肺強(qiáng)腎、通腑潤(rùn)腸來達(dá)到以補(bǔ)治秘的目的。臨床研究顯示，總有效率為92.50％。
　　 為了更加科學(xué)闡述其療效機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)在前期臨床研究的基礎(chǔ)上對(duì)藥效和作用機(jī)理進(jìn)行深入研究，將觀察養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒對(duì)慢傳輸型便秘小鼠的通便作用，并同時(shí)從分子水平入手，應(yīng)用蛋白免疫印跡方法和免疫組化的方法研究本復(fù)方對(duì)這種便秘模型小

4、鼠結(jié)腸Cajial間質(zhì)細(xì)胞、結(jié)腸肌間神經(jīng)叢血管活性腸肽(VIP)和P物質(zhì)(SP)含量的影響，進(jìn)而為揭示便秘發(fā)病機(jī)理和治療新藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分藥效學(xué)研究
　　 實(shí)驗(yàn)一：慢傳輸型便秘模型的制備
　　 目的：復(fù)制小鼠慢傳輸型便秘的模型
　　 材料與方法：將96只健康的普通級(jí)昆明種小鼠按性別、體重分層隨機(jī)分成正常組、模型組、麻子仁丸組、養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒低劑量組、養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒中劑量組和養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒高劑量組6

5、組，每組16只，雌雄各半。除正常組外，其余各組均建立模型。參照文獻(xiàn)報(bào)道，將造模小鼠按照2.5mg/kg的劑量每日一次皮下注射鹽酸嗎啡，正常組則注射等量等滲生理鹽水，連續(xù)注射45天，即可造成慢傳輸型便秘的小鼠動(dòng)物模型。
　　 結(jié)果：模型組小鼠大便明顯干結(jié)，呈圓珠狀或串珠狀，且排便粒數(shù)及重量均明顯下降，活動(dòng)減少，符合便秘的臨床表現(xiàn)，故認(rèn)為造模成功。
　　 結(jié)論：應(yīng)用鹽酸嗎啡按照2.5mg/kg的劑量，給小鼠每天一次皮下注射，

6、連續(xù)注射45天，此方法可以成功復(fù)制出小鼠慢傳輸型便秘的模型，且該模型安全性好。
　　 實(shí)驗(yàn)二：養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒對(duì)小鼠排便功能的影響
　　 目的：通過觀察養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒對(duì)小鼠排便功能的影響，判斷養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒治療慢傳輸型便秘的療效。
　　 材料與方法：造模成功后各組小鼠日一次灌胃給與不同藥液。其中正常組和模型組每日按0.4 ml/10g體重灌蒸餾水；麻仁軟膠囊組用蒸餾水將麻仁軟膠囊配制成1.5％的混懸液，按0.4ml/10g體重

7、日一次灌胃給藥，生藥量為0.6g/kg；養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒低劑量組將養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒合劑稀釋一倍，按0.4 ml/10g體重日一次灌胃給藥，生藥量為11.4g/kg；養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒中劑量組將養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒合劑原液按0.4 ml/10g體重日一次灌胃給藥，生藥量為22.8g/kg；養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒高劑量組將養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒合劑濃縮一倍，按0.4 ml/10g體重日一次灌胃給藥，生藥量為45.6g/kg。各組均連續(xù)灌胃給藥10天。在給藥期間，所有小鼠均自由攝食與飲水，每2天

8、稱重一次，并根據(jù)體重變化調(diào)整給藥劑量。第九天給藥前禁食不禁水12h，給藥后將濾紙鋪于飼養(yǎng)籠中進(jìn)行觀察，記錄給藥24h內(nèi)各組小鼠排便的總粒數(shù)及糞便重量。
　　 結(jié)果：模型組小鼠大便明顯干結(jié)，24小時(shí)排便粒數(shù)及重量均明顯下降，與正常組差異顯著(P<0.01)。灌胃治療后，各治療組小鼠的大便均有不同程度的恢復(fù)，尤其是養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒高劑量組，在排便數(shù)量及重量上均明顯高于模型組(P<0.01)，且大便外觀上與正常組已無差異。
　　 結(jié)

9、論：
　　 1.鹽酸嗎啡皮下注射復(fù)制出小鼠慢傳輸型便秘的模型穩(wěn)定性好。
　　 2.嗎啡造模和養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒合劑治療均對(duì)慢傳輸型便秘小鼠的體重?zé)o明顯影響。
　　 3.養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒可以增加慢傳輸型便秘小鼠的24小時(shí)排便粒數(shù)和排便重量，并呈現(xiàn)出顯著的量效關(guān)系。
　　 實(shí)驗(yàn)三：養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒對(duì)小鼠小腸墨汁推進(jìn)率的影響
　　 目的：通過觀察養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒對(duì)小鼠小腸墨汁推進(jìn)率的影響，判斷養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒治療慢傳輸型便秘的療效。<

10、br>　　 材料與方法：各組小鼠在第10天給藥前禁食不禁水12h，灌胃給藥，所有藥液中均含有2％的炭末。30min后脫頸椎處死小鼠，立即打開腹腔分離腸系膜，并分離小腸與大腸。剪取上端自幽門，下端至回盲部的小腸管，至于托盤上，輕輕將小腸拉成直線，測(cè)量腸管長(zhǎng)度為“小腸總長(zhǎng)度”，從幽門至墨汁前沿為“墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度”，計(jì)算炭末在腸管中的推進(jìn)率。
　　 結(jié)果：正常組小腸的墨汁推進(jìn)率是78.20％，模型組下降至65.08％，兩者有顯著性差異

11、(P<0.05)，而治療后各組的墨汁推進(jìn)率均明顯增加，高劑量組達(dá)到93.12％，不僅明顯高于模型組，且高于正常對(duì)照組(P<0.01)。
　　 結(jié)論：養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒可以顯著提高慢傳輸型便秘小鼠的小腸推進(jìn)率，進(jìn)而達(dá)到增強(qiáng)胃腸動(dòng)力、治療慢傳輸型便秘的作用。
　　 第二部分作用機(jī)制研究
　　 實(shí)驗(yàn)一：養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒對(duì)ICC、SP及VIP的分布和表達(dá)的影響
　　 目的：應(yīng)用免疫組化的方法探討?zhàn)B榮潤(rùn)腸舒治療慢傳輸型便秘的作用

12、機(jī)制。
　　 材料與方法：實(shí)驗(yàn)小鼠末次給藥后2小時(shí)，用25％烏拉坦按0.4 ml/100g的劑量腹腔麻醉，灌流固定后迅速打開腹腔，分離大腸，切取小鼠的近端結(jié)腸段組織約15mm，放入預(yù)先備好的裝有固定液的小瓶中二次固定，保存?zhèn)溆谩２捎妹庖呓M化的方法進(jìn)行染色處理，先在光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)的變化及結(jié)腸Cajial間質(zhì)細(xì)胞、結(jié)腸肌間神經(jīng)叢血管活性腸肽(VIP)和P物質(zhì)(SP)的分布和含量的變化。免疫組化結(jié)果判定方法：細(xì)胞漿出現(xiàn)褐色片狀或顆

13、粒狀物為c—Kit陽性，出現(xiàn)黃色或棕黃色物質(zhì)為SP、VIP陽性。
　　 結(jié)果：
　　 1.正常組小鼠結(jié)腸的ICC細(xì)胞分布于整個(gè)結(jié)腸肌層，且以環(huán)肌層和肌間叢區(qū)域分布最豐富。ICC細(xì)胞呈梭形、卵圓形或不規(guī)則形，并以胞體為中心向四周發(fā)出兩個(gè)或兩個(gè)以上的突起。細(xì)胞核大而明顯，胞質(zhì)相對(duì)較少，細(xì)胞膜較完整。與正常組比，模型組ICC陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，尤以環(huán)肌層和粘膜下環(huán)肌層表面區(qū)域減少地最為明顯，部分模型此區(qū)域ICC幾乎消失。殘存

14、的ICC其形態(tài)也出現(xiàn)異常，如細(xì)胞膜部分溶解，突起變短、變鈍等。治療后ICC細(xì)胞數(shù)增加，ICC細(xì)胞分布密度也明顯增大，病理改變得到改善。所有切片肌層中均可見SP和VIP陽性表達(dá)的細(xì)胞，只不過與正常組比，模型組SP、VIP陽性表達(dá)的細(xì)胞較少，分布稀疏，而治療后細(xì)胞分布相對(duì)較密集。陽性細(xì)胞多呈圓形或橢圓形，胞漿可見染成黃色或棕黃色的顆粒。
　　 2.模型組近端結(jié)腸組織c—Kit、SP、VIP陽性細(xì)胞均較正常對(duì)照組顯著減少，而治療后各治

15、療組的c—Kit、SP、VIP陽性細(xì)胞均較模型組增多，尤其是養(yǎng)榮高劑量組增加顯著(P<0.01)。
　　 結(jié)論：養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒合劑是通過調(diào)節(jié)動(dòng)物模型神經(jīng)遞質(zhì)(SP、VIP)的含量及ICC的數(shù)量和功能來調(diào)節(jié)結(jié)腸蠕動(dòng)，進(jìn)而達(dá)到治療慢傳輸型便秘的作用的。
　　 實(shí)驗(yàn)二養(yǎng)榮潤(rùn)腸舒對(duì)c—Kit蛋白含量的影響
　　 目的：應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測(cè)小鼠結(jié)腸c—Kit蛋白表達(dá)的變化，探討?zhàn)B榮潤(rùn)腸舒治療慢傳輸型便秘的作用機(jī)制。
　

16、　 材料與方法：實(shí)驗(yàn)小鼠末次給藥后2小時(shí)，脫頸處死，立即打開腹腔，分離大小腸，選取小鼠近端結(jié)腸組織約2cm，生理鹽水沖洗后，置于液氮中冷凍，-70℃保存?zhèn)溆?。采用western—blot的技術(shù)方法檢測(cè)小鼠結(jié)腸c—Kit蛋白表達(dá)的變化情況，并應(yīng)用ChemiImager5500凝膠成像分析軟件(America)分析，記錄每條蛋白電泳帶的灰度值，進(jìn)行定量分析。
　　 結(jié)果：c—Kit蛋白在模型組中的表達(dá)較正常組明顯降低(P<0.01