大黃治療慢傳輸型便秘的分子機制研究.pdf

1、目的：慢傳輸型便秘(slowtransitconstipation，STC)是一類以胃腸動力減弱為主要特點的頑固性便秘，其發(fā)病機制較為復雜，目前尚缺乏深入的認識。大黃是傳統(tǒng)中藥，具有顯著的致瀉和促進腸道蠕動的作用，但是其具體機制目前尚不清楚。為了進一步探討大黃治療便秘的機制，在既往研究工作的基礎上，我們應用復方苯乙哌啶建立大鼠慢傳輸型便秘模型，使用大黃治療便秘大鼠后，觀察結腸神經(jīng)病理學改變，利用蛋白質組技術篩選和分析便秘大鼠結腸組織中介

2、導大黃生物學作用的蛋白質分子，從蛋白質水平研究便秘的發(fā)生機制，為臨床防治慢傳輸型便秘及為研究新型治療便秘的藥物篩選作用靶點。 方法：以復方苯乙哌啶為造模藥物，給藥劑量為8mg/kg體重，建立大鼠慢傳輸型便秘模型。然后飼以含大黃粉的干飼料，劑量為480mg/kg體重，40天后，采用活性炭灌胃法測定腸道傳輸速度，同時進行結腸肌電檢測。然后處死大鼠，取近側(距盲腸約1cm)及遠側(距肛門約2cm)的結腸組織進行HE染色；對結腸肌間神經(jīng)

3、叢標本，采用組織化學染色法，顯示大鼠結腸肌間神經(jīng)叢內AchE能神經(jīng)和NOS能神經(jīng)；碘化鋅—鋨酸(ZIO)染色顯示大鼠結腸神經(jīng)系統(tǒng)內的ICC。將0.3g結腸組織(去除漿膜層)在液氮中充分研磨，稱重后按1ml/100mg的比例加入蛋白裂解液，提取大鼠結腸組織蛋白質進行雙向凝膠電泳。考馬斯亮蘭染色及脫色，對膠上消化后的差異蛋白點進行質譜分析。獲得的肽序列數(shù)據(jù)用Mascot軟件在NCBI的nr數(shù)據(jù)庫中搜尋。 結果：(1)便秘組大鼠腸道傳

4、輸速度比正常對照組明顯減慢，首粒黑便排出時間為357±24min，較對照組大鼠顯著延長(241±37min，p＜0.01)。大黃治療組大鼠腸道傳輸速度與便秘組相比明顯加快，差異顯著(255±15min，P＜0.01)。(2)便秘組大鼠結腸慢波出現(xiàn)雙向改變，大黃治療后頻率減慢組便秘大鼠結腸慢波頻率明顯加快(8.62±1.20次/minvs便秘組5.60±1.20次/min，p＜0.01)，振幅減少(0.33±0.05mvvs便秘組0.46

5、±0.05mv，p＜0.01)，波形仍表現(xiàn)為不規(guī)則的近似正弦波樣曲線；頻率加快組便秘大鼠經(jīng)大黃治療后結腸慢波頻率明顯減慢，(23.2l±3.86次/minvs便秘組30.23±3.86次/min，p＜0.01)，振幅強弱不等(0.19±0.03mvvs便秘組0.20±0.03mv，p＜0.01)，波形較不穩(wěn)定，且出現(xiàn)基線位移。(3)結腸切片HE染色發(fā)現(xiàn)便秘組大鼠均顯示粘膜慢性炎癥改變。結腸肌間神經(jīng)叢鋪片組化染色發(fā)現(xiàn)便秘大鼠結腸肌間神經(jīng)叢

6、內膽堿能神經(jīng)分布較稀疏，數(shù)量較少，但胞體增大，染色加深。大黃治療組大鼠結腸肌間神經(jīng)叢中的膽堿能神經(jīng)分布趨于正常，膽堿能陽性神經(jīng)元較多(陽性細胞數(shù)25.71±5.36vs便秘組14.32±4.60，p＜0.01；核漿比例0.71±0.21vs便秘組0.58±0.19，p＜0.01)。便秘組大鼠肌間神經(jīng)叢氮能神經(jīng)元分布較稀疏，數(shù)量較少，染色深淺不一，節(jié)間纖維較細小，染色較淡。大黃治療組大鼠肌間神經(jīng)叢氮能神經(jīng)元數(shù)量增多(陽性細胞數(shù)11.76±

7、2.31vs便秘組7.10±2.04，p＜0.01；弱陽性細胞數(shù)0.62±0.45vs便秘組2.21±1.38，p＜0.01)。ZIO染色顯示便秘大鼠結腸神經(jīng)系統(tǒng)內ICC分布不均勻，有的視野ICC密集，突起連接雜亂，有的視野ICC稀少，突起不能相互連接形成網(wǎng)絡。大黃治療組大鼠結腸肌間神經(jīng)叢中的ICC分布與正常大鼠類似，ICC突起相互連接形成網(wǎng)絡，ICC分布比較均勻。(4)利用雙向凝膠電泳(two-dimensionalgelelectr

8、ophoresis，2DE)分析了在不同狀況下大鼠結腸組織蛋白質表達的差異，在正常大鼠，便秘大鼠和大黃治療大鼠分別檢測到256個，293個和247個考染的蛋白質點。正常大鼠與便秘大鼠之間共有53個差異點，大黃治療大鼠與便秘大鼠之間共有37個差異點，正常大鼠與大黃治療大鼠之間共有21個差異點，我們利用MALDI-TOF-MS鑒定出6個差異點。(5)慢傳輸型便秘在其發(fā)生和治療的過程中有顯著的蛋白質表達差異。主要差異表達的蛋白質有：肥大細胞蛋

9、白酶(A1)，非特異性二肽酶(A2)，線粒體脫氫酶前體(A3)，類肌鈣蛋白Calponin(CaP，B1)，組蛋白H2B(B2)，鼠醛酮還原酶蛋白類似物(RAKb蛋白類似物，B3)。A1、A2、A3在便秘大鼠的膠圖中表達明顯下調而在大黃治療組大鼠的膠圖中表達明顯上調，B1、B2、B3在便秘大鼠的膠圖中表達明顯上調而在大黃治療組大鼠的膠圖中表達明顯下調。(6)類肌鈣蛋白Calponin(CaP)與胃腸道的運動狀態(tài)密切相關，胃腸運動增強，它

10、們的含量下降，反之則升高。與細胞能量代謝密切相關的線粒體琥珀酸脫氫酶、與粘膜免疫密切相關的肥大細胞蛋白酶在慢傳輸型便秘大鼠結腸組織中的表達均明顯下調。 結論：1.慢傳輸型便秘大鼠結腸壁內存在明顯的神經(jīng)病理學改變及ICC分布和數(shù)量的異常，結腸傳輸功能障礙可能與結腸肌間神經(jīng)叢病理改變及ICC分布和數(shù)量的異常有關。大黃可部分糾正便秘大鼠結腸膽堿能神經(jīng)、氮能神經(jīng)及ICC的異常，可能是大黃治療慢傳輸型便秘的機制之一。2.慢波頻率、振幅異常

11、可能是導致慢傳輸型便秘結腸傳輸減慢的重要因素，大黃可使便秘大鼠結腸異常的慢波頻率和振幅恢復，這可能是大黃治療便秘的機制之一。3.慢傳輸型便秘在其發(fā)生、發(fā)展和大黃治療的過程中有顯著的蛋白質表達差異。4.肥大細胞蛋白酶、線粒體琥珀酸脫氫酶、二肽酶在慢傳輸型便秘大鼠結腸組織中的表達明顯下調，提示慢傳輸型便秘大鼠結腸組織免疫反應性減弱，線粒體氧化還原功能障礙在慢傳輸型便秘的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用，慢傳輸型便秘大鼠腸道蛋白質的消化、吸收功能可