EIF-5A2基因在結(jié)直腸癌、卵巢癌和膀胱癌中的臨床病理學(xué)意義及功能的初步研究.pdf

1、研究背景與目的：近年來細(xì)胞遺傳學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，在人類頭頸、食管、乳腺、肺、胃腸、卵巢、前列腺、和膀胱等眾多惡性上皮性腫瘤中存在染色體3q或3q部分區(qū)段的高頻擴(kuò)增。提示在染色體3q的某些DNA擴(kuò)增區(qū)存在一個(gè)或多個(gè)關(guān)鍵的癌基因，其擴(kuò)增與表達(dá)異?？赡茉谀[瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。2001年，Guan等應(yīng)用染色體微切割及篩選雜交技術(shù)，從卵巢癌細(xì)胞的3q26.2高擴(kuò)增區(qū)段克隆了一個(gè)新的候選癌基因—eIF—5A2。由于該基因編碼的蛋白與真核翻譯起始

2、因子EIF—5A有82％的同源性，所以該基因被命名為eIF—5A2。以往的研究表明，eIF—5A基因在細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖中具有重要的作用；在HeLa細(xì)胞和中國(guó)倉鼠卵巢上皮細(xì)胞中，當(dāng)EIF—5A蛋白被抑制時(shí)，其細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖受到明顯抑制，而且可以引發(fā)細(xì)胞的凋亡。我們?cè)诼殉舶┑那捌隗w內(nèi)外研究中發(fā)現(xiàn)，eIF—5A2基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要的癌基因作用；EIF—5A2蛋白的過度表達(dá)與卵巢癌的惡性進(jìn)展有明顯的相關(guān)性。由于結(jié)直腸癌和膀胱癌等許多

3、惡性上皮腫瘤中也存在3q或3q部分區(qū)段的高頻擴(kuò)增，那么在結(jié)直腸癌和膀胱癌等惡性腫瘤中是否也存在著eIF—5A2基因的擴(kuò)增與異常表達(dá)？其是否與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)？能否成為評(píng)估腫瘤預(yù)后的新分子標(biāo)記物？等等，目前國(guó)內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本課題旨在探索eIF—5A2基因在結(jié)直腸癌、膀胱癌和卵巢癌中的擴(kuò)增與表達(dá)情況及其臨床病理學(xué)意義；同時(shí)探討其在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的癌基因作用。 材料和方法： 1.病例收集：收集中山大學(xué)附屬腫瘤

4、醫(yī)院、中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院和廣東省人民人醫(yī)院1990年到2005年間的結(jié)直腸腫瘤、卵巢腫瘤和膀胱癌患者手術(shù)切除的石臘包埋組織標(biāo)本及其相關(guān)的臨床病理學(xué)資料。在本研究選取的結(jié)直腸癌病例中，包括139例進(jìn)行局部結(jié)直腸癌切除術(shù)的腫瘤組織和相應(yīng)的癌旁正常粘膜組織；同時(shí)，收集了22例伴發(fā)的結(jié)直腸腺瘤的標(biāo)本和42例結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移病灶標(biāo)本。在選取的170例卵巢腫瘤病例中，包括有30例良性腺瘤、30例交界性腫瘤和110例惡性腫瘤；同時(shí)選取30例卵巢正常組織

5、作為對(duì)照。在膀胱癌病例的挑選中，選取了兩組接受不同治療方法的膀胱癌病例，一組為90例浸潤(rùn)型膀胱癌和50例癌旁的正常膀胱粘膜組織，另一組為112例淺表性膀胱癌和30例相應(yīng)的癌旁正常膀胱粘膜組織。另外，我們同時(shí)也收集了13對(duì)新鮮的淺表性(pTa/pT1)膀胱癌組織及其癌旁的正常粘膜組織。 2.方法：本研究中我們?cè)跇?gòu)建組織芯片的基礎(chǔ)上，應(yīng)用免疫組化、RT—PCR、蛋白印跡和熒光原位雜交的方法，檢測(cè)eIF—5A2基因在結(jié)直腸癌、卵巢癌和

6、膀胱癌中的表達(dá)與擴(kuò)增，并結(jié)合腫瘤的臨床病理學(xué)和預(yù)后資料，分析它們之間的相關(guān)性。在eIF—5A2基因功能的體外研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建RNA干擾的體外表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染進(jìn)入結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中并篩選穩(wěn)定表達(dá)的克隆。應(yīng)用RT—PCR和蛋白印跡方法檢測(cè)mRNA和蛋白的表達(dá)，并利用MTT、Transwell侵襲小室和平板克隆等實(shí)驗(yàn)方法研究細(xì)胞的增殖和體外侵襲浸潤(rùn)的能力。 結(jié)果： Ⅰ．eIF—5A2基因在結(jié)直腸癌、卵巢癌和膀胱癌中的

7、表達(dá)與擴(kuò)增及其臨床意義 1.結(jié)直腸癌：免疫組化結(jié)果顯示，分別有35.3％的結(jié)直腸腺瘤，53.2％的原發(fā)性結(jié)直腸癌和67.6％的轉(zhuǎn)移性癌組織出現(xiàn)EIF—5A2蛋白的過度表達(dá)；而全部的癌旁正常腸粘膜組織未發(fā)現(xiàn)EIF—5A2蛋白的過度表達(dá)。在本組結(jié)直腸癌中，EIF—5A2蛋白表達(dá)與腫瘤的淋巴血管浸潤(rùn)，局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均有顯著的相關(guān)性(P<0.05)。在伴隨淋巴血管浸潤(rùn)的病例中，有61.2％的腫瘤存在EIF—5A2過度表達(dá)，

8、明顯高于無淋巴血管浸潤(rùn)的腫瘤(36.6％)；而在伴有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(pTN1-2)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(pM1)的病例中，分別有63.8％和74.2％的腫瘤出現(xiàn)EIF—5A2過度表達(dá)，其過度表達(dá)率也明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(40.4％)和無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組(46.3％)。另外，EIF—5A2的過度表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖(Ki—67)顯著正相關(guān)(P<0.05)。本組FISH檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在97例成功進(jìn)行檢測(cè)和分析的結(jié)直腸癌病例中，有15例檢測(cè)到eIF—5A2

9、基因的擴(kuò)增，其中13例存在EIF—5A2蛋白的過度表達(dá)。 2.卵巢癌：免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別有6.7％的卵巢腺瘤，30.0％的卵巢交界性腫瘤，和52.7％的卵巢癌組織中出現(xiàn)EIF—5A2過度表達(dá)；而所有正常卵巢癌上皮組織則未發(fā)現(xiàn)該蛋白過度表達(dá)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，本組卵巢癌組織中EIF—5A2蛋白表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)類型、pT分期、pN分期，F(xiàn)IGO分期、以及細(xì)胞增殖(Ki—67)均有顯著的相關(guān)性(P<0.05)。進(jìn)一步，我們對(duì)EIF

10、—5A2表達(dá)與患者預(yù)后進(jìn)行了單因素生存分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EIF—5A2過度表達(dá)組患者的平均生存時(shí)間(39.0月)明顯短于正常表達(dá)組(69.5月，P<0.001)。多變量的Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，EIF—5A2蛋白表達(dá)是判斷本組患者總生存率的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)(P=0.043)。FISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，本組卵巢癌中有15.9％(10/63)的病例存在eIF—5A2基因擴(kuò)增，而且全部10例均存在EIF—5A2蛋白過度表達(dá)。 3.膀胱癌(浸潤(rùn)性膀胱癌)：

11、在免疫組化和FISH檢測(cè)有效的膀胱癌中，分別有45.3％(39/86)和10.6％(5/47)的病例存在EIF—5A2蛋白過度表達(dá)和基因擴(kuò)增。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，本組膀胱癌中EIF—5A2表達(dá)與患者的臨床病理特征(患者年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤分級(jí))均無明顯相關(guān)性，但與腫瘤細(xì)胞的增殖則有顯著的相關(guān)性(P=0.007)。對(duì)EIF—5A2表達(dá)與膀胱癌患者的預(yù)后進(jìn)行單因素生存分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白過度表達(dá)患者的平均生存時(shí)間(38.2月)顯著短于正常表

12、達(dá)的患者(52.9月，P＝0.001)。多變量的Cox回歸分析結(jié)果顯示，EIF—5A2蛋白表達(dá)(P=0.004)與腫瘤pT分期(P=0.005)均是評(píng)估患者總生存率的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。進(jìn)一步，我們對(duì)不同分級(jí)和臨床分期的腫瘤進(jìn)行了分層預(yù)后分析，結(jié)果顯示：EIF—5A2蛋白過度表達(dá)在G1/G2級(jí)(P=0.0009)，G3級(jí)(P=0.016)，pT1(P=0.0089)、pT2(P=0.0354)、pT3/4(P=0.0058)、pN0(P=0.

13、0039)、和pN1-2期(P=0.0093)的腫瘤中，均是評(píng)估腫瘤預(yù)后的有效指標(biāo)。 4.膀胱癌(淺表性膀胱癌)：免疫組化結(jié)果顯示，在112例淺表性膀胱癌(pTa/pT1)病例中，有38例(33.9％)檢測(cè)到EIF—5A2的過度表達(dá)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，本組膀胱癌中EIF—5A2表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤分級(jí)等臨床病理特征均無明顯相關(guān)性。單因素生存分析發(fā)現(xiàn)，EIF—5A2蛋白過度表達(dá)患者的術(shù)后無復(fù)發(fā)生存時(shí)間(22.2月)

14、和術(shù)后無進(jìn)展生存時(shí)間(36.2月)均明顯短于正常表達(dá)組患者(31.6月，P=0.002和40.7月，P=0.004)。進(jìn)一步多變量的Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，EIF—5A2蛋白過度表達(dá)是淺表性膀胱癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)(P=0.002)和術(shù)后進(jìn)展(P=0.007)的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。FISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，本組膀胱癌中有5.1％(3/59)的病例存在eIF—5A2基因的低水平擴(kuò)增(gain)，8.5％(5/59)的病例出現(xiàn)高水平擴(kuò)增(amplification

15、)。另外，在13對(duì)新鮮的膀胱癌組織中，發(fā)現(xiàn)有8例(61.5％)存在eIF—5A2 mRNA的表達(dá)上調(diào)，其中4例(30.8％)同時(shí)存在蛋白的表達(dá)上調(diào)。 Ⅱ.RNA干擾eIF—5A2基因在結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)其增殖和侵襲能力的影響 1.篩選eIF—5A2基因沉然的穩(wěn)定細(xì)胞株：限制性酶切凝膠電泳和DAN測(cè)序結(jié)果表明，兩條沉()eIF—5A2基因的DNA序列成功連接到RNAi表達(dá)載體(pGPU6/GFP/Neo)上。

16、熒光顯微鏡結(jié)果表明，eIF—5A2基因沉()質(zhì)粒shRNA-1和shRNA—2成功轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，并獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆。RT—PCR和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在shRNA-1和shRNA—2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的兩組細(xì)胞中，與對(duì)照組相比eIF—5A2的mRNA表達(dá)分別下降了87.2％和79.5％，蛋白表達(dá)則分別下降了90.2％和76.3％。 2.沉()eIF—5A2基因?qū)?xì)胞生物功能的影響：在shRNA-1和shRNA—2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的兩組

17、細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)沉()eIF—5A2基因的表達(dá)明顯抑制了細(xì)胞的增殖、侵襲和克隆形成能力，并導(dǎo)致G1期細(xì)胞數(shù)的增多。 結(jié)論： 1.EIF—5A2蛋白過度表達(dá)與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處血道轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)，可能在結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。 2.EIF—5A2蛋白在卵巢腫瘤中的表達(dá)隨腫瘤惡性程度的增加而表達(dá)上調(diào)，其過度表達(dá)與卵巢癌的局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而且是判斷卵巢癌患者生存的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。 3.在膀胱癌中

18、，EIF—5A2蛋白表達(dá)與腫瘤患者的臨床病理學(xué)參數(shù)無關(guān)，但可以作為評(píng)估浸潤(rùn)型膀胱癌整體生存的獨(dú)立指標(biāo)；同時(shí)也是判斷淺表性膀胱癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)與進(jìn)展的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。 4.在結(jié)直腸癌、卵巢痛和膀胱癌中，eIF—5A2基因的擴(kuò)增可能在其蛋白過度表達(dá)中起著重要的作用。 5.沉默eIF—5A2基因表達(dá)可明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖及其侵襲和轉(zhuǎn)移能力，并影響了細(xì)胞周期的進(jìn)展；eIF—5A2基因在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用，并