胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)法在化妝品胚胎毒性檢測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、化妝品作為人類日常生活用品，其安全性與人類健康密切相關(guān)?；瘖y品及其原料的毒性檢測(cè)是化妝品工業(yè)不可忽視的工作。胚胎毒性(embryotoxicity)是指一些化學(xué)物質(zhì)對(duì)胚胎的毒害作用，表現(xiàn)為影響胚胎的發(fā)育、導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯或胚胎畸形。在眾多毒性檢測(cè)中，化妝品的胚胎毒性檢測(cè)尤為重要。胚胎毒性檢測(cè)以體內(nèi)胚胎毒性實(shí)驗(yàn)為主，但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)周期長、模型建立較為困難、影響因素多、花費(fèi)大，而且需要大量動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。我國的化妝品工業(yè)在國民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位，

2、呈迅速增長的趨勢(shì)，出口增長尤為迅速，其中歐盟國家是主要的出口對(duì)象之一。而我國目前的化妝品檢測(cè)仍采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，將會(huì)受到歐盟動(dòng)物實(shí)驗(yàn)禁令很大影響。為了達(dá)到歐盟的要求、減少動(dòng)物使用和避免我國生產(chǎn)地化妝品不被歐盟禁止使用，急需要建立和采取體外胚胎毒性替代實(shí)驗(yàn)對(duì)化妝品及其原料的胚胎毒性進(jìn)行檢測(cè)。為此，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局和廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局委托我們建立中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)化妝品胚胎毒性體外替代實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，并負(fù)責(zé)對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)化妝品胚胎

3、毒性檢測(cè)的有效性進(jìn)行驗(yàn)證和培訓(xùn)。本研究分為兩個(gè)部分：
　　 第一部分：小鼠胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)化妝品化合物胚胎毒性。
　　 目的：通過對(duì)三種小鼠ES細(xì)胞系(D3、E14.1和E14TG2a)進(jìn)行比較，選取合適的細(xì)胞系并參照ECVAM的EST標(biāo)準(zhǔn)方案建立小鼠胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)法，進(jìn)行陽性對(duì)照5-氟尿嘧啶、陰性對(duì)照青霉素G和六種測(cè)試化合物(氫醌、丁香酚、鄰苯二甲酸二丁酯、三氧化二銻、硝酸釹六水合物和三聚氰胺)3T3細(xì)胞和E14T

4、G2a細(xì)胞細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和E14TG2a細(xì)胞分化抑制實(shí)驗(yàn)，得到三個(gè)實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)終點(diǎn)，將化合物進(jìn)行胚胎毒性分類。并采用陽性對(duì)照5-氟尿嘧啶和陰性對(duì)照青霉素G對(duì)所選細(xì)胞系和所建立的EST體系的有效性進(jìn)行探討。
　　 方法：⑴采用小鼠ES常規(guī)培養(yǎng)液對(duì)ES細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，采用胰酶進(jìn)行傳代。對(duì)三種小鼠ES細(xì)胞系(D3、E14.1和E14TG2a)的增殖和分化能力進(jìn)行比較。⑵3T3細(xì)胞采用胰酶消化成單細(xì)胞后按1×103個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于96

5、孔培養(yǎng)板中。ES細(xì)胞采用胰酶消化成單細(xì)胞后按1×104個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)液去LIF進(jìn)行培養(yǎng)。⑶ES細(xì)胞消化成單細(xì)胞后按3.75×104個(gè)細(xì)胞/ml進(jìn)行懸滴(每滴20μl)培養(yǎng)3天、懸浮培養(yǎng)2天和貼壁培養(yǎng)5天進(jìn)行分化，共10天。整個(gè)分化過程均有化合物暴露，化合物濃度按1∶10倍比稀釋，并設(shè)溶劑對(duì)照組，每組化合物濃度保持不變。
　　 ⑷將每種化合物的3T3細(xì)胞和ES細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和ES細(xì)胞的分化抑制實(shí)驗(yàn)

6、的濃度-反應(yīng)曲線繪制在一起，并對(duì)每種化合物的3條曲線進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：①小鼠ES細(xì)胞接種于已照射失去增殖活性的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上，在含有LIF(1000U/ml)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，克隆形態(tài)良好，成鳥巢樣突起，邊界清晰，增殖活躍，一周傳代2～3次。②3T3細(xì)胞在H-DMEM培養(yǎng)基+10％胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)下，細(xì)胞成梭形、折光性好，增殖活躍，一周傳代3次。③3T3細(xì)胞和E14TG2a細(xì)胞在檢測(cè)的幾種化合物不同濃度作用下，顯微

7、鏡下觀察細(xì)胞存活和增殖受到不同程度抑制，化合物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制呈劑量依賴關(guān)系，且E14TG2a細(xì)胞對(duì)化合物敏感性高于3T3細(xì)胞。④E14TG2a細(xì)胞經(jīng)過懸滴培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)共10天分化后，顯微鏡下觀察含搏動(dòng)心肌細(xì)胞的孔數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和六種測(cè)試化合物的溶劑對(duì)照組含跳動(dòng)心肌細(xì)胞的孔數(shù)均在21孔及其以上，可以判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。⑤按照EST的預(yù)測(cè)模型利用三個(gè)反應(yīng)終點(diǎn)數(shù)值計(jì)算將陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和六種與化妝品相關(guān)的測(cè)試化合

8、物的胚胎毒性進(jìn)行分類。結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性對(duì)照5-FU、氫醌、丁香酚和三氧化二銻屬于強(qiáng)胚胎毒性化合物；鄰苯二甲酸二丁酯、硝酸釹六水合物和三聚氰胺屬于弱胚胎毒性化合物，而陰性對(duì)照PenG屬于無胚胎毒性化合物。
　　 結(jié)論：⑴參照ECVAM的EST標(biāo)準(zhǔn)體系采用小鼠胚胎干細(xì)胞系E14TG2a建立了小鼠EST體系，并被批準(zhǔn)作為中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(化妝品生殖和發(fā)育毒性的胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)法2006B475X)。⑵成功利用建立的小鼠E

9、ST體系對(duì)化妝品中禁用或限用的六種化合物的胚胎毒性進(jìn)行分類。⑶小鼠胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)法可用于化妝品工業(yè)以及其他工業(yè)如制藥業(yè)等的胚胎毒性檢測(cè)。
　　 第二部分：食蟹猴胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)法初步檢測(cè)化妝品化合物胚胎毒性。
　　 目的：選取食蟹猴皮膚成纖維細(xì)胞(cmDF)和食蟹猴胚胎干細(xì)胞(cmES)代替小鼠胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)法體系中的3T3細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，建立以食蟹猴細(xì)胞為基礎(chǔ)的EST體系。利用建立的食蟹猴EST體系對(duì)陽性對(duì)照5-氟尿嘧

10、啶、陰性對(duì)照青霉素G和化妝品中禁用或限用的六種化合物(氫醌、丁香酚、鄰苯二甲酸二丁酯、三氧化二銻、硝酸釹六水合物和三聚氰胺)的胚胎毒性進(jìn)行初步檢測(cè)，進(jìn)行cmDF和cmES細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，得到該兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)終點(diǎn)IC50cmDF和IC50 cmES，對(duì)化合物對(duì)食蟹猴的胚胎毒性進(jìn)行初步評(píng)估。
　　 方法：⑴無菌條件下取成年食蟹猴耳部皮膚，用眼科剪剪碎后加入0.25％胰酶消化成小組織團(tuán)塊，加入含血清培養(yǎng)液終止消化后離心，重懸后用H

11、-DMEM培養(yǎng)液+10％FCS培養(yǎng)。⑵采用Knockout-DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基含bFGF的培養(yǎng)液培養(yǎng)于MEF上。采取1mg/ml的膠原酶Ⅳ進(jìn)行消化傳代。⑶cmDF采用胰酶消化成單細(xì)胞后按1×104個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)2小時(shí)后加入不同濃度的化合物繼續(xù)培養(yǎng)?；衔餄舛劝?∶10倍比稀釋，設(shè)溶劑對(duì)照和陽性對(duì)照組。3天、5天后各換液一次，每孔化合物濃度的保持不變。培養(yǎng)10天后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各孔的OD值。將溶劑對(duì)照組

12、OD值設(shè)為100％，將各濃度組OD值與溶劑對(duì)照組OD值相比，分別得到各濃度的百分率，繪制濃度-反應(yīng)曲線。⑷cmES克隆采用膠原酶消化成含50-100細(xì)胞的細(xì)胞小團(tuán)塊，按5×103個(gè)細(xì)胞團(tuán)塊/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)2小時(shí)后加入不同濃度的化合物繼續(xù)培養(yǎng)?；衔餄舛劝?∶10倍比稀釋，設(shè)溶劑對(duì)照和陽性對(duì)照組。培養(yǎng)3天、5天后各換液一次，化合物濃度的保持不變。培養(yǎng)10天后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各孔的OD值。
　　 結(jié)果：①cm

13、ES堿性磷酸酶染色為強(qiáng)陽性，鏡下見克隆中細(xì)胞密集區(qū)出現(xiàn)紫黑色顆粒，作為對(duì)照的飼養(yǎng)層細(xì)胞不能被染色。cmES免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示cmES的OCT-4、SSEA-4及TRA-1-60表達(dá)強(qiáng)陽性，SSEA-1和SSEA-3不表達(dá)。②MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果與顯微鏡下觀察的結(jié)果一致。根據(jù)MTT測(cè)得的值繪制濃度-反應(yīng)曲線，并根據(jù)濃度-反應(yīng)曲線計(jì)算得到每種化合物對(duì)cmDF的半數(shù)生長抑制濃度(IC50 cmDF)。③根據(jù)MTT測(cè)得的OD值繪制濃度-反應(yīng)

14、曲線，并根據(jù)濃度-反應(yīng)曲線計(jì)算得到每種化合物對(duì)cmES的半數(shù)生長抑制濃度(IC50 cmES)。與每種化合物對(duì)小鼠E14TG2a細(xì)胞的IC50值相比，除兩種化合物IC50 E14TG2a值稍低于IC50 cmES，其余均高于IC50 cmES。cmES對(duì)各種化合物的敏感性總體高于E14TG2a細(xì)胞。
　　 結(jié)論：⑴成功分離培養(yǎng)了食蟹猴皮膚來源的成纖維細(xì)胞，并可進(jìn)行持續(xù)傳代培養(yǎng)。成功對(duì)cmES進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定，cmES表達(dá)OCT-4