PBC膽汁排泄障礙相關(guān)分子的篩選和功能研究.pdf

1、【背景】
　　近二十年來，隨著人們生活習慣和環(huán)境因素的改變，PBC全球患病率提高了近十倍。作為重要的非病毒性肝病之一，其危害性不容忽視，已受到相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜业母叨戎匾暋?br>　　應(yīng)用熊去氧膽酸類藥物（UDCA）能顯著改善PBC患者肝臟的生化功能，在一定程度上延緩疾病的進展，但并不能從根本上治愈PBC，且患者早期缺乏特異性癥狀，往往因肝硬化失代償期的嚴重并發(fā)癥就診才得以診斷，失去了治療的最佳時期。目前研究認為PBC發(fā)病可能跟環(huán)境、遺

2、傳、及免疫因素有關(guān)，但具體病因及發(fā)病機制仍不明。由于PBC的臨床表現(xiàn)、病理變化、生化指標的典型特征均為肝內(nèi)膽汁淤積，因此從膽汁排泄障礙角度入手，有望加深對PBC發(fā)病機制的認識。
　　內(nèi)、外源性物質(zhì)及膽汁酸鹽等成分吸收入肝細胞起始于肝細胞基底側(cè)膜，經(jīng)過肝細胞的生物轉(zhuǎn)化及運輸后經(jīng)過頂端側(cè)膜即膽管側(cè)膜分泌入小膽管，形成膽汁。肝細胞膽管膜側(cè)存在著許多轉(zhuǎn)運相關(guān)分子，在膽汁排泄中發(fā)揮著重要的作用。MDR3為磷脂轉(zhuǎn)運體，負責將磷酸卵磷脂由胞內(nèi)向

3、胞外的轉(zhuǎn)運。BSEP為膽鹽轉(zhuǎn)運體，負責牛黃鵝脫氧膽酸、牛熊去氧膽酸鹽、?；悄懰岬饶扄}的轉(zhuǎn)運。ABCG5/8參與膽固醇的轉(zhuǎn)運。目前已發(fā)現(xiàn)多種膽汁淤積性疾病均是由于肝細胞膽管膜側(cè)的轉(zhuǎn)運相關(guān)分子基因突變或蛋白變異所致，如PFIC-1與定位在染色體18q21-22的ATP8B1基因突變導(dǎo)致FIC1缺陷有關(guān)，PFIC-2是由膽汁酸鹽輸出泵基因突變導(dǎo)致，PFIC-3與定位于染色體7q21的多藥耐藥蛋白MDR3/ABCB4基因突變有關(guān),Dubin-J

4、ohnson綜合征發(fā)生的重要原因是由于MRP2/ABCC2突變。PBC患者中，也發(fā)現(xiàn)了肝細胞膽管側(cè)轉(zhuǎn)運分子表達分布的變化，與BSEP和MDR3基因突變、AE2表達下調(diào)和功能降低有關(guān)，但是目前已知的轉(zhuǎn)運體的變化并不能完全解釋PBC膽汁排泄障礙這一復(fù)雜的病理生理現(xiàn)象，因此篩選與PBC發(fā)病密切相關(guān)的膽汁排泄相關(guān)分子有望闡明PBC膽汁排泄障礙的機制。
　　【目的】
　　制備和篩選與PBC相關(guān)的肝細胞膽管膜側(cè)轉(zhuǎn)運相關(guān)分子單克隆抗體，鑒

5、定其抗原并初步探討其在PBC發(fā)病中的作用。
　　【方法】
　　1．利用我們前期建立的蔗糖和percoll聯(lián)合的密度梯度離心方法提取PBC肝臟肝細胞膽管側(cè)膜小體。
　　2．應(yīng)用單克隆抗體雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，并通過ELISA、免疫組化方法及免疫熒光雙標共聚焦方法篩選特異性分布于肝細胞并呈極性分布的單克隆抗體。
　　3．收集正常、不同肝臟疾病包括PBC的肝臟，通過免疫組化方法觀察單克隆抗體在不同疾病狀態(tài)下表達分布

6、的變化篩選與PBC相關(guān)的單克隆抗體并通過統(tǒng)計方法分析其病理意義。
　　4．通過免疫電鏡技術(shù)觀察1F9在肝細胞內(nèi)的亞細胞定位，分析其可能的作用。
　　5．通過免疫沉淀、westernblot方法初步鑒定1F9抗原。
　　【結(jié)果】
　　1．從PBC肝臟中分離的肝細胞膽管側(cè)膜小體為形態(tài)均一、結(jié)構(gòu)規(guī)整、直徑約400nm左右的囊狀小體，肝細胞膽管側(cè)膜小體（CMV）ALP活性顯著高于肝細胞血竇側(cè)膜小體（SMV），Na+K+A

7、TP酶活性顯著低于SMV，說明我們成功分離了PBCCMV。
　　2．制備的單克隆抗體經(jīng)過特異性篩選后共有四株即1F2、1F3、1F5、1F9可極性分布于肝細胞膜，與肝細胞膽管膜側(cè)標志分子CD13共定位結(jié)果證實這些抗體均特異性分布于肝細胞膽管膜側(cè)。
　　3．1F2、1F3、1F5、1F9在正常及不同疾病狀態(tài)下的表達分布的免疫組化結(jié)果提示1F9可能與PBC相關(guān)，進一步對40例正常肝臟、30例乙肝病毒性肝炎、20例脂肪性肝炎、20

8、例Gilbert、20例藥物性肝病及148例PBC的肝臟進行免疫組化染色并進行統(tǒng)計學分析，證實1F9與其他肝病無明顯的相關(guān)性，僅與PBC密切相關(guān)，一方面，隨著PBC病情的進展1F9在PBC肝臟的表達呈增多趨勢，另一方面，在正常肝臟及其他肝臟疾病肝細胞呈極性分布的1F9在PBC時極性分布消失且隨病情進展紊亂程度加重。
　　4．免疫電鏡結(jié)果顯示1F9抗原位于肝細胞頂端內(nèi)涵體囊壁上，通過比較其與肝細胞頂端內(nèi)涵體標志分子Rab11a在組織

9、中的分布及分子量，發(fā)現(xiàn)1F9抗體識別的抗原并不是Rab11a，可能為肝細胞頂端內(nèi)涵體的新的標志分子。
　　【結(jié)論】
　　1．我們共獲得了四株在肝細胞膽管膜側(cè)特異性分布的單克隆抗體，它們分別是1F2、1F3、1F5、1F9。
　　2．獲得的其中一株與PBC密切相關(guān)、對PBC具有重要病理診斷價值—單克隆抗體1F9，其抗原可能通過影響內(nèi)涵體的功能而影響肝細胞極性分子的準確定位最終影響肝細胞的極性及膽汁的排泄。
　　3．