近視眼發(fā)病機(jī)制的研究——視黃酸對(duì)鞏膜成纖維細(xì)胞基因表達(dá)的影響.pdf

1、近視是最普遍的屈光不正，人群中有著很高的發(fā)病率，其患病率各國(guó)報(bào)道不一。在北美、歐洲和澳大利亞人群中發(fā)病率為20-30％，據(jù)報(bào)道在東南亞地區(qū)的發(fā)病率高達(dá)80％。近視的主要損害在于眼球增大進(jìn)而引起脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜的病理性改變，如脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜變性，視網(wǎng)膜脫離等。超過(guò)90％的高度近視患者有眼球病理的改變。因此在發(fā)達(dá)國(guó)家中，它成為致盲的首要原因之一。近視眼作為一個(gè)全球性的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問(wèn)題，已引起更多人的關(guān)注。目前還沒(méi)有任何一種方法能夠明確地顯示可延緩近

2、視的發(fā)展。歸根結(jié)底是因?yàn)榻暤陌l(fā)病機(jī)制不清，難以找到有效的方法來(lái)治療，所以探討近視的發(fā)病機(jī)制對(duì)近視眼的防治具有重要的意義。 近期的研究表明眼球的大小和形狀是由鞏膜在生長(zhǎng)過(guò)程中的功能形成的，鞏膜的重塑在近視的發(fā)展中是一個(gè)內(nèi)在的特征，鞏膜生化的改變是其質(zhì)變的前提，最終可導(dǎo)致近視的發(fā)展。視黃酸在眼球發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，參與了視覺(jué)引導(dǎo)的眼球生長(zhǎng)。最近的研究發(fā)現(xiàn)視黃酸在視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜上均能合成和分泌，且能影響鞏膜的代謝。而視黃酸是

3、通過(guò)什么途徑最后對(duì)鞏膜發(fā)生作用，由此引起鞏膜細(xì)胞和基質(zhì)的變化機(jī)制目前尚不清楚。因此，從分子和基因水平探討視黃酸在人鞏膜細(xì)胞的作用將為近視眼發(fā)病機(jī)制的研究提供可靠的理論根據(jù)，對(duì)近視眼的防治具有重要的意義。 第一部分透鏡誘導(dǎo)豚鼠屈光不正的實(shí)驗(yàn)研究 目的：觀察凹透鏡和凸透鏡對(duì)豚鼠眼球生長(zhǎng)和屈光變化的影響，建立透鏡誘導(dǎo)型屈光不正動(dòng)物模型，探討CRALBP在實(shí)驗(yàn)性近視眼鞏膜中的作用。 方法：3～4周齡有色豚鼠47只，隨機(jī)分

4、成7組，右眼分別戴不同度數(shù)的凸或凹透鏡，其左眼作為對(duì)照眼，戴鏡前和戴鏡后第11天分別測(cè)量其眼軸長(zhǎng)度、屈光度，觀察其變化。用HE染色測(cè)量誘導(dǎo)近視眼鞏膜和對(duì)照眼鞏膜的厚度變化。通過(guò)免疫組化和蛋白質(zhì)免疫印跡的方法檢測(cè)CRALBP在豚鼠誘導(dǎo)近視眼和對(duì)照眼的視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜和鞏膜的表達(dá)。 結(jié)果：戴鏡后第11天，與戴鏡前相比，戴+4.00D、+8.00D組的豚鼠眼分別增加了+1.46D與+1.58D的相對(duì)遠(yuǎn)視(P＜0.05)；戴-4.00D、

5、-8.00D、-15.00D組的豚鼠分別增加了-2.92D、-3.17D、-3.10D的相對(duì)近視(P＜0.01)；而戴0.00D、-2.00D組的豚鼠的屈光度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。所有七組豚鼠的眼軸長(zhǎng)度在實(shí)驗(yàn)眼和對(duì)照眼之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。分別將對(duì)照眼和透鏡誘導(dǎo)近視眼后極部鞏膜HE染色，結(jié)果顯示誘導(dǎo)近視眼鞏膜比對(duì)照眼鞏膜變薄。免疫組化結(jié)果顯示，和對(duì)照眼相比，誘導(dǎo)近視眼的CRALBP在脈絡(luò)膜和鞏膜中的表達(dá)明顯降

6、低，在視網(wǎng)膜中的表達(dá)升高。Westernblotting結(jié)果和免疫組化結(jié)果相對(duì)應(yīng)，CRALBP在誘導(dǎo)近視眼鞏膜中的表達(dá)明顯降低。 結(jié)論：豚鼠眼球生長(zhǎng)發(fā)育受透鏡影響，可被用來(lái)建立一種簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的屈光不正動(dòng)物模型。和對(duì)照眼相比較，誘導(dǎo)近視眼鞏膜變薄。CRALBP在眼球發(fā)育以及近視眼形成過(guò)程中可能參與了RA的轉(zhuǎn)運(yùn)與調(diào)節(jié)。 第二部分視黃酸對(duì)體外人鞏膜成纖維細(xì)胞影響的研究 目的：探討全反式視黃酸(all-transretin

7、oicacidat-RA)對(duì)培養(yǎng)的人鞏膜成纖維細(xì)胞(humanscleralfibroblastsHSF)的形態(tài)、增殖以及細(xì)胞周期的影響，從而探討at-RA在近視眼鞏膜重塑中的作用。 方法：HSF傳代至第四代后以1×105/孔的密度接種于96孔板或以1×106的密度接種于25cm2的培養(yǎng)瓶，以含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶子80％～90％時(shí)，培養(yǎng)液轉(zhuǎn)換為含濃度為5×10-6M、1×10-5M、2×10-

8、5M，5×10-5Mat-RA的DMEM/F12。以未加RA組作正常對(duì)照，于12、24、48、72小時(shí)后觀察HSF形態(tài)；96孔板以濃度1×10-4M，1×10-5M，1×10-6M，1×10-7M，1×10-8Mat-RA作用HSF24、48、72小時(shí)后用MTT法測(cè)定其增殖情況；以濃度5×10-6M、1×10-5的at-PA作用于HSF，24、48小時(shí)后用FCM檢測(cè)細(xì)胞周期情況。 結(jié)果：不同at-RA的劑量對(duì)HSF的形態(tài)、增殖有

9、程度不同的負(fù)性影響。At-RA刺激后HSF細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞收縮，突起減少，部分裂解，胞漿內(nèi)有空泡和顆粒形成，細(xì)胞之間的間隙增寬，細(xì)胞變得細(xì)長(zhǎng)，呈束狀或不規(guī)則排列。在高濃度(1×10-4M)時(shí)，細(xì)胞大部分裂解，看不到完整的細(xì)胞存在，只有裂解的碎片。MTT法顯示at-RA對(duì)鞏膜成纖維細(xì)胞有明顯的抑制作用，該效應(yīng)呈劑量依賴(lài)性反應(yīng)。FCM結(jié)果顯示經(jīng)at-RA刺激HSF24、48小時(shí)后，和對(duì)照組比較，隨著at-RA濃度和時(shí)間的增加，G0/G1期

10、細(xì)胞的比例逐漸上升，而S期和G2期細(xì)胞比例相應(yīng)下降，細(xì)胞被阻滯在G0/G1期。 結(jié)論：RA可以抑制體外培養(yǎng)的人鞏膜成纖維細(xì)胞增殖和DNA合成，RA的濃度變化最終引起鞏膜成纖維細(xì)胞形態(tài)和功能的改變。RA可能是近視發(fā)生過(guò)程中的信使物質(zhì)。 第三部分視黃酸對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞中CRABP、CRALBP、MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響 目的：利用基因芯片技術(shù)篩選RA培養(yǎng)HSF后相關(guān)基因群的表達(dá)變化，以探討RA作用于HSF

11、的相關(guān)通路。用不同濃度RA培養(yǎng)HSF后，HSF表達(dá)CPABP、CRALBP、MMP-9和TIMP-1的變化，以從分子水平解釋RA的作用機(jī)制。 方法：HSF傳代至第四代后以1×106的密度接種于25cm2的培養(yǎng)瓶，以含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)后，培養(yǎng)液轉(zhuǎn)換為含濃度為1×10-5MRA的DMEM/F12，以未加RA組作正常對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48后用Trizol一步法提取細(xì)胞中的總RNA，對(duì)樣品RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，

12、通過(guò)雜交與清洗，對(duì)標(biāo)記的人類(lèi)全基因組寡核苷酸芯片進(jìn)行掃描，采用圖像分析軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，然后對(duì)芯片上的數(shù)據(jù)用Lowess方法進(jìn)行歸一化，最后以差異為兩倍的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定差異表達(dá)基因。將細(xì)胞以103～106傳代到25cm2培養(yǎng)瓶，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，加入含不同濃度RA的DMEM/F12，以單純加入DMEM/F12組做對(duì)照，培養(yǎng)48小時(shí)?；蛘邔⒓?xì)胞用胰酶消化后以104傳代到六孔板中，進(jìn)行細(xì)胞爬片培養(yǎng)24小時(shí)

13、后，同樣加入含濃度為1×10-5MRA的DMEM/F12，以單純加入DMEM/F12組做對(duì)照，培養(yǎng)48小時(shí)。采用RT-PCR法檢測(cè)每組細(xì)胞中CPABP-1mRNA和CPABP-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和熒光免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)CRABP-1、CPALBP、MMP-9、TIMP-1抗體在兩組細(xì)胞中的表達(dá)；用Westernblotting方法檢測(cè)兩組細(xì)胞中CRABP-1、CPALBP、MMP-9、TIMP-1蛋白的表達(dá)。

14、 結(jié)果：在用2×10-5RA刺激HSF48小時(shí)后，人類(lèi)全基因組寡核苷酸芯片的21571個(gè)基因共有562個(gè)基因表達(dá)有差異。其中運(yùn)輸36、轉(zhuǎn)錄調(diào)控30、信號(hào)60、逆境反應(yīng)25、代謝133、發(fā)育67、細(xì)胞組織與生物發(fā)生15、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)18、分化3、細(xì)胞周期25、細(xì)胞粘連31、細(xì)胞凋亡15個(gè)基因表達(dá)有差異。用不同濃度RA培養(yǎng)HSF后，和對(duì)照組比較，CPABP-1mRNA水平?jīng)]有明顯變化，而CRABP-2mRNA水平在刺激24小時(shí)后有輕微降低，但4

15、8小時(shí)后則明顯降低。免疫細(xì)胞化學(xué)、熒光免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblotting顯示CRABP-1和CRALBP在RA刺激HSF細(xì)胞后，表達(dá)輕微降低，MMP-9表達(dá)基本無(wú)變化而TIMP-1表達(dá)輕微降低。 結(jié)論：基因芯片對(duì)于研究RA對(duì)HSF影響的基因篩選快速有效，可同時(shí)發(fā)現(xiàn)多條基因通路變化。視黃酸結(jié)合蛋白在RA抑制HSF活性中發(fā)揮了一定的作用；MMPs及TIMPs參與了HSF的ECM的重塑；它們?cè)诮曆鄣男纬膳c發(fā)展中起了重要的作