天然來源化合物抗HIV的活性篩選和ADS-J1抑制HIV進入的作用機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的,嚴重威脅人類健康的傳染性疾病。據(jù)UNAIDS統(tǒng)計,2008年全球感染HIV的人數(shù)有3340多萬,而08年新增的HIV感染者數(shù)量為270萬,因艾滋病死亡的人數(shù)高達200萬。我國自1985年首次發(fā)現(xiàn)HIV感染者,截止2009年10月底,估計有74萬人發(fā)生了感染,且2009年新增的感染者數(shù)量為4.8萬。在非洲的有

2、些國家,HIV的感染率達總?cè)丝?0％以上。因此,預(yù)防和治療艾滋病,已不僅僅是挽救個人生命的問題,而是關(guān)系到民族存亡的大事。由于有效的艾滋病疫苗在短時期內(nèi)還難以面世,開發(fā)高效、安全和廉價的抗HW藥物依然是挽救艾滋病人生命的關(guān)鍵舉措,也是艾滋病防治的當(dāng)務(wù)之急。目前應(yīng)用于臨床的抗HIV藥物中逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑有26種、進入抑制劑和整合酶抑制劑才3種,但前兩類藥物容易引起病毒耐藥現(xiàn)象和嚴重的毒副作用。因此,為了治療感染了耐藥病毒的艾滋

3、病患者,組成更多有效的“雞尾酒”治療方案,必須大力開發(fā)后兩類新作用機制的抗艾滋病藥物。其中HW進入抑制劑,由于能在病毒感染的早期進行阻斷,更為有效地預(yù)防和治療HIV感染,而倍受重視。
　　 已被批準的HW進入抑制劑有兩種,分別是靶向HIV跨膜蛋白gp41的多肽藥物T-20(也叫融合抑制劑)和靶向HIV輔助受體CCR5的受體拮抗劑Maraviroc。Maraviroc只能作用于利用CCR5作為輔助受體的R5病毒,對以CXCR4為輔

4、助受體的X4病毒無效,而T-20則對兩類病毒均具有抑制作用。然而,T-20是多肽藥物,不能口服,容易被體內(nèi)的蛋白酶降解,而且價格昂貴不是廣大的發(fā)展中國家HIV感染者所能承受的,因此開發(fā)出具有類似作用機制的非肽類HIV進入抑制劑迫在眉睫。
　　 本課題根據(jù)實驗室在相關(guān)領(lǐng)域積累的經(jīng)驗,與相關(guān)的研究組合作對大量的有機合成小分子和天然產(chǎn)物提取成分進行抑制HIV進入的體外活性篩選,并進一步的開發(fā)完善新的實驗方法,研究公認的HIV-1抑制劑

5、ADS-J1對gp41產(chǎn)生抑制作用的具體位點。
　　 第一章 天然來源化合物抗HIV的活性篩選
　　 目的：
　　 通過對茶黃素衍生物單體進行結(jié)構(gòu)改造,改變原樣品顏色深,水溶性差等缺點,考察改造后的化合物體外抑制HIV-1包膜介導(dǎo)的細胞融合活性和相關(guān)的生物學(xué)活性,確定改造后成分的可利用度及進一步改造的方向,為該類化合物作為HIV進入抑制劑的作用機制研究提供依據(jù)。對番石榴葉提取成分進行體外的免疫,分生活性檢測,篩選

6、出能在HIV-1進入階段發(fā)揮作用的成分,并初步探討其作用機理,填補該類成分在HIV-1進入抑制研究方面的空白。
　　 方法:
　　 1.茶黃素類衍生物的結(jié)構(gòu)改造和番石榴葉成分提取。茶黃素衍生物是文獻中研究最多的從紅茶中提取的TF1(theaflavin),TF2A(theaflavin-3-monogallate),TF3(theaflavin-3,3'-digallate),分別對它們的苯并酚酮七元環(huán)中的1”,2”,3

7、”,7”4個雙鍵進行還原得到對應(yīng)的化合物TF1-4H,TF2A-4H,TF3-4H。具體操作是在Pt/C的催化下,通入H2還原,然后過濾除掉催化劑,對還原產(chǎn)物用反相柱層析分離純化得到相應(yīng)的化合物。參照相關(guān)文獻,番石榴葉經(jīng)兩次乙醇提取的浸膏用SA-1型大孔樹脂吸附,然后用80％(V/V)的乙醇溶液洗脫,得到總皂苷的粗品。番石榴葉的乙醇提取物用FL-1型大孔樹脂吸附,然后用0.2％NaOH溶液洗脫,得到總黃酮的粗品。番石榴葉水浸泡液回流提取

8、得到揮發(fā)油成分。
　　 2.以上樣品先用抗體特異性的檢測抗原的酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)進行第一次篩選,有效的通過濃度梯度實驗考察量效關(guān)系,計算抑制率并確定半數(shù)抑制濃度(Half of the inhibitingconcentration,IC50)范圍。進一步的用可直觀的從六螺旋束(six-helical bundle,6-HB)條帶變化中反映化合物抑制強

9、弱的天然非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native polyacrylamide gel eleetrophoresis,N-PAGE)確證活性。
　　 3.另外用HIV-1包膜介導(dǎo)的細胞.細胞融合實驗考察改造后的茶黃素類化合物和番石榴葉的有效成分細胞水平的抑制活性。根據(jù)融合時的細胞狀態(tài),對樣品進行四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)實驗檢測相應(yīng)的細胞毒性。
　　 結(jié)論:
　　 1.茶多酚衍生物是文獻報道能對HI

10、V感染的多個環(huán)節(jié)都有抑制效果的化合物,茶黃素衍生物低濃度時沒有表現(xiàn)出抑制CD4,趨化因子受體與gp120的相互作用卻表現(xiàn)出抑制gp41核心結(jié)構(gòu)6-HB形成的活性,且觀察發(fā)現(xiàn)化合物中含有沒食子?；谋炔缓幕钚院?含的個數(shù)越多活性越好,推測其活性可能是通過化合物自身帶的微弱的負電荷與靶點(如N末端574位的賴氨酸)的正電荷形成離子鍵實現(xiàn)的。茶多酚自身的多酚結(jié)構(gòu)使它具有上述活性,但是正因為含有多個酚羥基使化合物整體易氧化,不穩(wěn)定,且與相并的

11、酚酮七元環(huán)一起形成一個大共軛體系使得化合物顏色較深,水溶性也不好。我們的研究通過對三個衍生物的酚酮七元環(huán)的雙鍵進行還原,在不破壞酚羥基的前提下盡量減少生色基團,并對改造后的產(chǎn)物進行體外活性檢測。還原后化合物的顏色變淺,水溶性也增加了。ELISA,N-PAGE實驗的結(jié)果都顯示改造后化合物表現(xiàn)出良好的抑制六螺旋束形成的活性。細胞融合實驗顯示茶黃素衍生物表現(xiàn)出與文獻報道值相似的活性,結(jié)構(gòu)改造后的三個化合物活性比改造前還好,推測可能是因為改造后

12、化合物水溶性提高,穩(wěn)定性增強,且空間構(gòu)象也發(fā)生了一些變化,相同條件下到達靶位的有效濃度提高,更加有利于化合物與靶點的結(jié)合。這些結(jié)果既為進一步的結(jié)構(gòu)改造提供了方向又在化合物的作用機制研究方面提供了有力的證據(jù)。
　　 2.番石榴葉提取物總黃酮和總皂苷雖然是混合成分,但主要成分黃酮和皂苷含量都在55％以上。二者都能在很大范圍內(nèi)安全有效的抑制HIV-1包膜介導(dǎo)的細胞融合,這說明二者可以在HIV的進入階段起到抑制作用,且細胞毒性實驗證明在

13、有效范圍內(nèi)樣品對細胞的生長沒有抑制作用。而靶向gp41的抗體免疫實驗ELISA表明二個樣品都可以在微克每毫升的水平抑制gp41核心構(gòu)象6-HB的形成,該結(jié)果還被N-PAGE實驗證實,這說明二者在進入過程中的抑制作用可能是通過抑制了該過程中很重要的環(huán)節(jié)六股螺旋體的結(jié)構(gòu)形成來實現(xiàn)的。
　　 第二章 ADS-J1抑制HIV進入的作用機制研究
　　 目的：
　　 通過建立和完善酸性非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Acid na

14、tivepolyacrylamide gel electrophoresis AN-PAGE),研究和探討ADS-J1與gp41相互作用的機制。
　　 方法:
　　 建立并完善AN-PAGE,在已有的ELISA,N-PAGE等結(jié)果的支持下更清楚直接的反映ADS-J1(4-羥基-5-((E)-(4-(5-羥基-6-((E)-2-甲氧基-5-磺苯基)二氮烯基)-7-磺基萘-2-苯基氨基)-6-苯胺-1,3,5-三嗪-2-苯基

15、氨基)-5-甲氧基-2-甲基苯)二氮烯基)萘-2,7-二磺酸在HIV-1gp41上的作用位點,為其機制研究提供直接可靠的證據(jù)。
　　 結(jié)論:
　　 AN-PAGE的結(jié)果表明,從含有20000個化合物的化合物庫中篩選出來的偶氮化合物ADS-J1對HIVgp41的作用是通過與gp41核心結(jié)構(gòu)中的NHR同源三聚體螺旋結(jié)構(gòu)表面的疏水深穴的第574位賴氨酸相互作用來實現(xiàn)的,可能是由于ADS-J1自身的磺酸基團與賴氨酸的正電荷之間形