蝦夷扇貝種群遺傳結(jié)構(gòu)分析和種質(zhì)評(píng)估.pdf

1、蝦夷扇貝作為引進(jìn)種，經(jīng)過幾十年的培育與發(fā)展，已經(jīng)完全適應(yīng)了我國渤海及黃海北部海域的生存環(huán)境。但是伴隨著蝦夷扇貝育種及養(yǎng)殖業(yè)的逐步發(fā)展、養(yǎng)殖持續(xù)時(shí)間的延展、養(yǎng)殖規(guī)模的逐漸擴(kuò)大，在養(yǎng)殖過程中也逐漸出現(xiàn)了一系列的問題，如近幾年中國養(yǎng)殖海區(qū)出現(xiàn)的蝦夷扇貝養(yǎng)殖群體成活率低、患病率高、個(gè)體生長緩慢等問題，這是否與蝦夷扇貝引入時(shí)個(gè)體數(shù)量有限又經(jīng)多年的累代養(yǎng)殖，進(jìn)而導(dǎo)致其遺傳多樣性降低有關(guān)？而已有研究結(jié)果，由于研究方法不同、樣品數(shù)量和取樣范圍有別，可能

2、導(dǎo)致研究結(jié)果差異較大，甚至存在分歧。因此非常有必要在中國主要養(yǎng)殖海區(qū)開展全面準(zhǔn)確地蝦夷扇貝群體的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析和種質(zhì)評(píng)估工作。
　　首先，本文總結(jié)了蝦夷扇貝的生長、生物學(xué)特征、遺傳多樣性以及生殖發(fā)育等方面的研究現(xiàn)狀，分析了目前蝦夷扇貝養(yǎng)殖中存在并亟需解決的人工育苗育種及養(yǎng)殖等問題。據(jù)已有研究報(bào)道，蝦夷扇貝的繁殖期主要受水溫的影響，呈現(xiàn)溫度相關(guān)性，中國定居群體的繁殖期為3-5月，繁殖盛期的水溫為5.0-7.0℃左右，幼體的生長最適

3、溫度與原產(chǎn)地日本相比沒有顯著變化，為15℃左右。在攝食方面，根據(jù)已有研究初步推斷，目前中國蝦夷扇貝定居群體的攝食習(xí)性則主要以硅藻為主。中國定居群的生長狀況同樣受到養(yǎng)殖密度的影響，據(jù)已有報(bào)道，在直徑30cm、層高12 cm的圓柱形養(yǎng)殖籠內(nèi)，最適宜的養(yǎng)殖密度是10個(gè)/層。而對(duì)于底播養(yǎng)殖，其播種量也應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)厮虻木唧w生態(tài)容量確定。而在群體遺傳學(xué)方面，綜合分析現(xiàn)有研究報(bào)道，可以初步得出推論，相較于其原產(chǎn)地日本群體，目前蝦夷扇貝中國群體已出現(xiàn)遺

4、傳多樣性下降的現(xiàn)象，具體的下降程度仍沒有統(tǒng)一的意見和結(jié)論。中國蝦夷扇貝各群體已產(chǎn)生遺傳分化，但具體分化程度、各群體遺傳多樣性現(xiàn)狀同樣沒有統(tǒng)一結(jié)論?；谏鲜鐾普?，本研究為系統(tǒng)闡明蝦夷扇貝中國增養(yǎng)殖群體和定居群體與原產(chǎn)地日本群體間的遺傳關(guān)系，開展了系統(tǒng)的研究。
　　其次，為深化對(duì)蝦夷扇貝基因組的認(rèn)識(shí)、全面了解蝦夷扇貝微衛(wèi)星分布頻率和數(shù)量，本研究運(yùn)用第二代高通量測序技術(shù)進(jìn)行蝦夷扇貝簡化基因組測序(RAD-seq)，從基因組水平上闡明蝦夷

5、扇貝基因組微衛(wèi)星特征。測序共獲得序列總長92,551,435 bp，經(jīng)過濾篩選獲得259,535個(gè)contig，其中包含微衛(wèi)星序列3,618條，經(jīng)引物設(shè)計(jì)共獲得3,460對(duì)微衛(wèi)星引物。在所得微衛(wèi)星位點(diǎn)中，分布最多的重復(fù)基元為三核苷酸重復(fù)，占45.87％；AT重復(fù)類型所占比例最高，為總SSR的14.91%。采用6個(gè)蝦夷扇貝基因組DNA對(duì)60條引物進(jìn)行初篩，共有47對(duì)引物可擴(kuò)增出清晰條帶、雜帶少易于鑒別等位基因，即引物的有效擴(kuò)增率為78.3

6、%。其中，經(jīng)過退火溫度優(yōu)化完成篩選獲得27對(duì)表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性并能對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的基因分型的SSR引物。48個(gè)個(gè)體進(jìn)行種群遺傳學(xué)評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)分析，所有27個(gè)位點(diǎn)在測試群體中共檢測到87個(gè)等位基因，單個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)在2-6之間，平均為3.2222；有效等位基因數(shù)(Ne)在1.4113-3.8114之間，平均值為2.3617；觀測雜合度(Ho)分布范圍為0.0833-0.9792，平均值為0.5833；期望雜合度(He)分布范圍為

7、0.2945-0.7454，平均值為0.5464；多態(tài)性信息含量(PIC)在0.2490-0.6895之間，平均為0.4724，其中14個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為高度多態(tài)性(PIC＞0.5)，11個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為中度多態(tài)性(0.5＞PIC＞0.25)，2個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為低度多態(tài)性(PIC＜0.25)。“哈迪-溫伯格平衡”檢驗(yàn)的結(jié)果表明，經(jīng)Sequential Bonferroni校正后，5個(gè)位點(diǎn)嚴(yán)重偏離平衡?？绶N擴(kuò)增在不同物種中取得不同程度上的成功，27條引

8、物在海灣扇貝和櫛孔扇貝中分別擴(kuò)增成功20條和17條。本研究結(jié)果表明，采用高通量測序開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記是簡單可行的，本研究所開發(fā)的微衛(wèi)星引物可以用于蝦夷扇貝的種群遺傳學(xué)分析和多樣性鑒定，在扇貝的相關(guān)遺傳學(xué)研究中同樣具有很大的參考和利用價(jià)值。
　　再者，為了闡明中國主要養(yǎng)殖區(qū)與原產(chǎn)地蝦夷扇貝群體遺傳多樣性的關(guān)系，對(duì)中國主要蝦夷扇貝養(yǎng)殖群體進(jìn)行種質(zhì)評(píng)估。本研究利用線粒體細(xì)胞色素b(Cyt b)基因標(biāo)記對(duì)蝦夷扇貝6個(gè)群體(長島底播增殖群、海洋

9、島底播增殖群、獐子島底播增殖群、旅順自然群、“獐子紅”人工選育群以及日本青森陸奧灣群)進(jìn)行種質(zhì)狀況評(píng)估，研究結(jié)果表明：6個(gè)群體120個(gè)個(gè)體的Cyt b基因序列共檢測到20種單倍型，其中“獐子紅”人工選育群單倍型最少，日本群體單倍型最為豐富，兩者單倍型多樣性指數(shù)分別為0.10000和0.88400。分子方差分析(AMOVA)發(fā)現(xiàn)，日本群體與中國群體間變異百分比為15.34%，明顯高于作為一個(gè)基因池時(shí)群體間遺傳變異水平，就中國組群而言，其8

10、3.41%的遺傳變異來自于群體內(nèi)部，組內(nèi)群體間的變異只占1.52%，說明中國群體個(gè)體間的遺傳變異遠(yuǎn)大于群體間的遺傳變異。Fst分析顯示，中國群體與日本群體之間發(fā)生了中等水平的遺傳分化(0.07455~0.17895, Fst＞0.05）。以遺傳距離矩陣構(gòu)建群體間分子系統(tǒng)樹(UPGMA樹)，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖顯示中國5個(gè)群體先聚為一支，再與日本群體聚為一支。由此可見，中國養(yǎng)殖區(qū)的蝦夷扇貝與日本原產(chǎn)地群體間已出現(xiàn)明顯的遺傳分化，且蝦夷扇貝中國群體的

11、遺傳多樣性處于較低水平。本文研究結(jié)果可為蝦夷扇貝的種質(zhì)資源保護(hù)與可持續(xù)開發(fā)用提供理論依據(jù)。
　　最后，為了澄清蝦夷扇貝中國定居群體和日本原產(chǎn)地群體間的譜系關(guān)系，本研究取樣6個(gè)中國蝦夷扇貝主要底播增殖群體，1個(gè)自然群體以及1個(gè)人工繁育群體，并與原產(chǎn)地日本青森縣陸奧灣自然群體樣品進(jìn)行合并分析，樣品總數(shù)共計(jì)251個(gè)。采用二代測序技術(shù)，構(gòu)建GBS文庫，通過高通量測序獲得大量SNP數(shù)據(jù)信息，進(jìn)而開展系統(tǒng)進(jìn)化樹分析、主成分分析和群體遺傳結(jié)構(gòu)分

12、析。主要結(jié)果如下：總測序量約95.73G，平均每個(gè)個(gè)體的Raw data約381.4M。經(jīng)過嚴(yán)格的過濾，共獲得高質(zhì)量的Clean data約95.72G，平均每個(gè)個(gè)體的Clean data約381.34M。Q20≥93%，Q30≥85%，樣本GC分布正常，測序質(zhì)量較高。經(jīng)過嚴(yán)格的過濾和篩選，本研究共計(jì)開發(fā)獲得38251個(gè)共有SNP位點(diǎn)。經(jīng)分析，中國蝦夷扇貝各群體相對(duì)于日本群體已經(jīng)出現(xiàn)了一定程度的遺傳分化；雖然中國各群體間的分化程度并不高