動態(tài)觀察混合細胞共微囊化移植對急性肝衰竭大鼠CT-1，STAT3，COX-2的影響.pdf

1、[目的]： 本研究將大鼠肝細胞和睪丸支持細胞混合培養(yǎng)共微囊化后，移植入肝衰竭大鼠腹腔內(nèi)，初步探討其對急性肝衰竭大鼠預(yù)后的影響及對肝組織內(nèi)心肌營養(yǎng)素-1(cardiotrophin-1，CT-1)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3(signaltransducersandactivationoftranscription3，STAT3)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的影響及意義。 [方法]：

2、 1、胰酶+EDTA灌注法分離大鼠肝細胞，膠原酶和胰酶二次消化法分離乳鼠睪丸支持細胞。 2、氣流切割法制備含肝細胞或含肝細胞與睪丸支持細胞以20:1混合的微囊3、大鼠隨機分為五組：A組(正常對照組)；B組(肝衰竭模型組)：腹腔注射D-氨基半乳糖(D-Gal)建立大鼠急性肝衰竭模型；C組(裸肝細胞組)；D組(微囊化肝細胞組)；E組(混合細胞共微囊化組)。后面三組在造模后18h分別腹腔注射2ml的裸肝細胞懸液、微囊化肝細胞懸液、微囊

3、化混合細胞懸液，造模后24、48、72、120和168h分別隨機取6只大鼠，動態(tài)觀察肝臟病理學(xué)和血生化指標(biāo)。取肝組織用免疫組織化學(xué)方法檢測cox-2蛋白的表達，半定量RT-PCR方法檢測CT-1、STAT3mRNA的表達。 [結(jié)果]： 1、原代肝細胞分離：大鼠肝細胞產(chǎn)量約為6×107/只，存活率大于90％；睪丸支持細胞純度達90％以上。 2、微囊直徑在600-800μm左右，且肝細胞、睪丸支持細胞在微囊化前后存活

4、率對照發(fā)現(xiàn)兩者沒有顯著性差異(P＞0.05)。 3、腹腔注射D-Gal24h后，肝病理學(xué)表現(xiàn)為大鼠肝索結(jié)構(gòu)破壞，小葉結(jié)構(gòu)模糊不清，肝細胞廣泛壞死，壞死區(qū)周圍肝細胞發(fā)生不同程度的氣球樣變及嗜酸性變，小葉內(nèi)及匯管區(qū)有淋巴細胞和巨噬細胞為主的炎細胞浸潤，這表明急性肝功能衰竭動物模型成功建立。 4、各組大鼠肝功能檢驗發(fā)現(xiàn)，造模后6h，模型組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)就開始顯著(P＜0.05)，到4

5、8h達高峰，72小時后開始顯著下降(P＜0.05)。造模48h后，各治療組ALT、AST較模型組顯著下降(P＜0.05)，以混合共微囊組為著。 5、造模后7d，發(fā)現(xiàn)大鼠腹腔內(nèi)微囊多聚集于大網(wǎng)膜及腸系膜之間，未見粘連情況。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，微囊有不同程度的變形，部分微囊可見少量的松散纖維包裹，但微囊內(nèi)仍可見游離的肝細胞或混有散在的睪丸支持細胞。兩組的微囊形態(tài)學(xué)改變表現(xiàn)無明顯差異。 6、肝組織中CT-1mRNA正常組很少表達，

6、造模后12h，模型組開始顯著升高(P＜0.05)，到48小時達高峰，混合微囊組CT-1在72h、120h、168h均高于其他各組。STAT3的表達在造模后6h較正常組顯著升高(P＜0.05)，48h達最高峰。各治療組在造模后48h的表達量較模型組顯著升高(P＜0.05)，混合微囊組更為顯著。免疫組化結(jié)果表明正常組未見COX-2蛋白表達，其他各組可見陽性表達，以中央靜脈匯管區(qū)及壞死區(qū)周圍表達最為明顯。造模后6h表達量逐漸增多，至48-72

7、h時達高峰，各治療組在48h后較模型組升高。 [結(jié)論]： 1、采用胰酶+EDTA灌注法分離肝細胞，可獲得較高產(chǎn)量和活力的肝細胞，與膠原酶分離法相比，大大節(jié)省了實驗成本。 2、采用膠原酶+胰酶二步消化法分離睪丸支持細胞，可獲得較高純度和數(shù)量的睪丸支持細胞。 3、海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉制備微囊效果理想，微囊制作技術(shù)可行性高，但仍需進一步提高微囊的穩(wěn)定性和均一性。 4、混合肝微囊化移植組對肝衰竭