MicroRNA-223與RhoB在GFP陽性大鼠胚胎脊髓源性神經(jīng)干細胞中的表達.pdf

1、第一部分GFP陽性大鼠胚胎脊髓源性神經(jīng)干細胞的獲取和鑒定
　　目的：探討GFP(綠色熒光蛋白)陽性大鼠胚胎脊髓源性神經(jīng)干細胞（Neural stem cells,NSCs）的獲取，并對所獲取細胞進行相關鑒定，為第二步實驗提供實驗細胞基礎。
　　方法：顯微解剖分離胚胎大鼠脊髓組織,用酶消化和機械分離法制成單細胞懸液,在含有表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)及N2、B27的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),

2、傳代后分別在相差顯微鏡下進行形態(tài)學觀察并用免疫細胞化學方法鑒定巢蛋白（Nestin）、神經(jīng)元核蛋白（Neuronal nuclei，NeuN）及膠質纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）的表達。
　　結果：分離獲取的GFP陽性大鼠胚胎脊髓源神經(jīng)干細胞在無血清培養(yǎng)基（Serum free medium，SFM）中生長良好，原代及傳代培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞表達巢蛋白(nestin)；而且用血

3、清誘導分化后神經(jīng)干細胞均有NeuN和GFAP蛋白陽性表達。
　　結論：采用酶消化及機械吹打相結合的方法能從大鼠胚胎脊髓組織中獲得神經(jīng)干細胞（Neural stem cell，NSCs）,且保持完整的分化潛能，為下一步實驗奠定了基礎。
　　第二部分 MicroRNA-223與 RhoB在大鼠胚胎脊髓源性神經(jīng)干細胞中的表達及其相關性
　　目的：檢測miR-223及RhoB蛋白在脊髓源性神經(jīng)干細胞（Neural stem c

4、ells，NSCs）中的表達情況,并用統(tǒng)計學方法初步分析兩者的關系。
　　方法：選取E14天、E16天、E18及E20天的孕鼠，分離培養(yǎng)脊髓來源神經(jīng)干細胞（Neural stem cell，NSC），對4組細胞利用熒光定量PCR、western blot分別檢測miR-223和RhoB蛋白的表達,并且進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：熒光定量PCR檢測顯示miR-223在4組NSC細胞中都有表達,其中miR-223在18天組NSC

5、s中的表達明顯高于14天組、16天組、20天組，各組間的表達差異具有顯著性。利用Western blot檢測RhoB蛋白在4組NSC細胞中的表達,結果顯示RhoB在4組細胞中均有表達，在14天、16天組細胞中的表達最高，在18天及20天組的表達則相對較低。利用Gel-Pro analyzer灰度軟件將RhoB蛋白的Western blot結果進行條帶灰度分析,然后采用Spearman相關性統(tǒng)計學方法對miR-223的熒光定量PCR表達結