番茄LEACT1的功能研究及機(jī)制分析.pdf

1、番茄黃化曲葉病是影響番茄生產(chǎn)的嚴(yán)重病害，該病是由雙生病毒科番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl virus，TYLCV)引起。番茄一旦感染了黃化曲葉病，葉片就會(huì)出現(xiàn)卷曲皺縮，黃化等癥狀，進(jìn)而導(dǎo)致坐果率下降，番茄嚴(yán)重減產(chǎn)，并且品質(zhì)也會(huì)下降。番茄栽培種中缺乏抗黃化曲葉病毒的抗性基因，僅在近緣野生番茄品種中發(fā)現(xiàn)了Ty-1，Ty-2，Ty-3，Ty-4，Ty-5等抗性位點(diǎn)。Ty-2是抗病效果最好的一個(gè)基因。目前抗病品種

2、的選育是通過(guò)近緣野生種和栽培種雜交，將抗病基因轉(zhuǎn)育到栽培品種中。我們對(duì)含有抗性位點(diǎn)Ty-2的番茄材料CLN2777A和感病材料4840進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組差異分析，發(fā)現(xiàn) TYLCV侵染后，LeACT1在抗病材料中表達(dá)上調(diào)，而在感病材料中其表達(dá)下降，推測(cè)該基因可能參與了抗病過(guò)程。本研究首先利用 RT-PCR克隆該基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。然后通過(guò)熒光定量 RT-PCR對(duì)其進(jìn)行組織表達(dá)以及誘導(dǎo)表達(dá)差異分析。同時(shí)利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）

3、以及轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)對(duì)LeACT1進(jìn)行功能分析。另外，利用煙草瞬時(shí)侵染對(duì) LeACT1的啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)特征分析。最后，測(cè)定了轉(zhuǎn)基因植株的PAL酶活，初步探討其抗性機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：
　　通過(guò)RT-PCR的方法克隆該基因，并命名為L(zhǎng)eACT1。測(cè)序結(jié)果表明該基因編碼區(qū)為1332bp，編碼443個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為50.5KD，等電點(diǎn)為6.07。盡管抗感材料中該基因編碼區(qū)沒(méi)有差異，但是在啟動(dòng)子區(qū)域抗感材料之前的相似性僅為89％。

4、
　　利用Realtime RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)LeACT1在葉片中的表達(dá)量較其他組織低，在花蕾，皮層以及根中的表達(dá)量較高。另外，葉片誘導(dǎo)表達(dá)分析結(jié)果表明在抗病材料中，TYLCV處理3d后，LeAct1基因表達(dá)量開(kāi)始上升并在處理后5天達(dá)到最高值。構(gòu)建該基因與GFP4融合的亞細(xì)胞定位載體并瞬時(shí)侵染煙草，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白在細(xì)胞核及細(xì)胞膜上均有分布。將來(lái)源于抗病材料的啟動(dòng)子構(gòu)建到PBI101載體上，通過(guò)煙草瞬時(shí)侵染分別與病毒蛋白基因共注

5、射，利用GUS染色研究啟動(dòng)子的表達(dá)特征。結(jié)果表明，TYLCV各個(gè)蛋白基因都能誘導(dǎo)番茄LeACT1啟動(dòng)子的活性，其中AC2和C1的誘導(dǎo)作用最為顯著。構(gòu)建LeACT1的基因沉默載體，分別將抗感番茄材料中的目的基因沉默，并通過(guò)Real-time RT-PCR檢測(cè)VIGS的沉默效率，表明目的基因的表達(dá)量下降60%，但表型并未發(fā)生明顯改變。對(duì)沉默植株接種TYLCV，15d后沉默植株中的病毒量是對(duì)照的30倍，同時(shí)，葉片出現(xiàn)扭曲、皺縮等畸形表型。構(gòu)建

6、LeACT1的過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化本氏煙，篩選出陽(yáng)性植株9株。取其中目的基因表達(dá)量最高的4個(gè)株系進(jìn)行抗性鑒定分析。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)TYLCV的抗性顯著提高，相對(duì)病毒數(shù)較費(fèi)轉(zhuǎn)基因植株下降40%-90%。為了驗(yàn)證LeACT1的抗性是否具有廣譜性，同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株接種落葉型黃萎病V991，對(duì)照野生型病指達(dá)到85.36%，而3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的病指僅為24.35%，38.19%和58.33%。接種15d后轉(zhuǎn)基因株系的TYLCV病毒數(shù)較對(duì)照顯著降