可注射納米纖維微球聯(lián)合BMP-2可控緩釋技術(shù)在牙本質(zhì)再生組織工程中的應用研究.pdf

1、由齲病,牙周病和創(chuàng)傷所引起的牙齒缺損和缺失是目前人類較常見且經(jīng)常發(fā)生的疾病。這些牙齒缺損和缺失往往會影響咀嚼效率,語言功能,面部美觀甚至身心健康。現(xiàn)在的修復方法主要是依賴于銀汞、樹脂、玻璃離子以及牙膠等材料,這些材料往往都難以達到與天然牙齒相似的物理和化學結(jié)構(gòu),導致有缺陷的臨床修復效果。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為發(fā)展天然牙齒替代物提供了契機。牙齒組織工程技術(shù)發(fā)展需要三大要素:合適的細胞,生物可降解支架以及優(yōu)勢的生長因子。
　　支架在組織

2、工程再生中有不可或缺的作用。近年來,各種三維多孔支架被用來提供給細胞粘附,增殖,分化以及新組織形成所需的物理化學和生物三維微環(huán)境。然而,對于不規(guī)則形狀的組織或缺損往往需要復雜的設(shè)計或合成單層支架來滿足形狀需求?？勺⑸涞募毎d體能通過簡單的注射來填充整個缺損位點,使得整個手術(shù)過程簡單化。近期,我們實驗小組成功合成了新型的可注射納米纖維微球(nanofibrous microspheres,NF-MS),期待將其應用于不規(guī)則缺損的齲壞而新生

3、牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。同時建立乳酸-羥基乙酸(lactic-co-glycolic acid,PLGA)微球包裹的骨形態(tài)蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP-2)緩釋系統(tǒng),聯(lián)合可注射NF-MS,驗證此體系是否能更好的促進根尖牙乳頭干細胞(stem cell from apical papillar,SCAP)向成牙本質(zhì)樣細胞分化,產(chǎn)生類牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。目前,NF-MS在牙組織工程領(lǐng)域的應用仍為空白。BMP-2作為

4、生長和分化因子誘導骨組織再生已有大量報道,但其對人SCAP的影響卻知之甚少。建立一個有效的BMP-2緩釋系統(tǒng),對于維持BMP-2在體內(nèi)的活性,防止其降解,維持其有效的生物學濃度十分關(guān)鍵,并具有重要的臨床意義。
　　本研究首先通過掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察,DNA含量測定,實時定量PCR,免疫熒光染色,免疫組化染色以及鈣含量測定等方法比較新型的可注射NF-MS與傳統(tǒng)的實心微球(s

5、olid-interior microspheres,SI-MS)在體內(nèi)體外促進SCAP成牙分化的能力;其次,通過ALP活力測定,鈣含量測定,實時定量PCR及免疫組化染色等方法,評估在BMP-2作用下,SCAP在體外單層細胞培養(yǎng)和體外體內(nèi)NF-MS上的3D培養(yǎng)體系中向成牙本質(zhì)樣細胞分化以及形成牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的能力;最后采用SEM,Elisa,Von Kossa及免疫組化染色等技術(shù)評估BMP-2緩釋系統(tǒng)聯(lián)合NF-MS對SCAP在體內(nèi)向成牙本

6、質(zhì)樣細胞分化并形成牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的影響。我們得出主要結(jié)果與結(jié)論如下:
　　1.與SI-MS相比較,SCAP在NF-MS上的形態(tài)大多更圓更立體,有更多的基質(zhì)沉積,增殖速度更快;在成牙誘導3天和7天時,SCAP在NF-MS上的ALP活性顯著高于SI-MS;在成牙誘導2周和4周時,Col I、BSP、OCN和DSPP與成牙分化相關(guān)的基因表達水平在兩種微球上均被上調(diào)。在NF-MS上,DSPP和BSP基因在2周和4周時上調(diào)水平明顯高于SI-M

7、S,而Col I和OCN的表達水平只有在4周時明顯高于SI-MS。在4周時DSPP蛋白在NF-MS上的表達最明顯,而2周時DSPP蛋白在SI-MS上幾乎無表達。體內(nèi)標本可見NF-MS組所形成的組織更致密,微球可均勻分布在新生組織中,并被大量的細胞和新生膠原所包裹,部分微球發(fā)生退化。而在SI-MS組微球大多聚集在一起,僅有少量的細胞和新生膠原包裹,形成了較少組織。同時NF-MS組顯示了更多的鈣沉積和DSPP蛋白的陽性表達。由此表明與普通的

8、SI-MS相比,NF-MS在體內(nèi)和體外更有利于SCAP向成牙方向分化和礦化。
　　2.與對照組相比,100 ng/ml的BMP-2對單層培養(yǎng)的SCAP增殖有一定的影響,卻顯著促進了SCAP的ALP的活力和礦化能力;在體外SCAP與NF-MS的3D培養(yǎng)體系中,BMP-2在7天和14天時明顯提高了SCAP的ALP活性并在4周時顯著提高了鈣含量。而Col I在2周、OCN在4周和BSP和DSPP在2周和4周時基因的表達水平與對照組相比有

9、顯著提高;相應的DSPP蛋白的表達水平在2周和4周時也隨之升高;皮下注射結(jié)果顯示:與對照組相比,BMP-2組所含膠原較多,且有類牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)產(chǎn)生,礦化結(jié)節(jié)更明顯,DSPP蛋白免疫組化染色顯示陽性。由此我們得出結(jié)論BMP-2無論在單層培養(yǎng)或3D培養(yǎng)中,均能促進SCAP向成牙方向的分化。
　　3.盡管可溶性的BMP-2有效促進了SCAP的在體內(nèi)體外的成牙分化,但由于其易在注射位點流失并在體內(nèi)快速失活,其潛在的臨床應用受到限制,因此我們

10、采用雙乳化法成功制成了BMP-2 PLGA緩釋微球來解決體內(nèi)重復給藥的問題。BMP-2在PLGA微球上的體外緩釋方式為多相釋藥模式,第一天和第二天均爆釋16％后,10天到35天期間由快速釋放變成緩慢釋放模式,平均每天約0.81%,從42天到49天又出現(xiàn)一個快速釋放期,總釋放率約為22%;皮下注射4周后BMP-2組礦化效果不明顯,8周后BMP-2組出現(xiàn)了明顯的礦化,且25μg BMP-2組的礦化效果明顯高于5μg BMP-2組。組織切片可

11、見大量的骨樣牙本質(zhì)出現(xiàn)在25μg BMP-2組,而5μg BMP-2組骨樣牙本質(zhì)的含量較少;25μg和5μg的BMP-2組均可見DSPP免疫組化染色陽性;體內(nèi)基因表達分析可見,所有BMP-2組的Col I,BSP,OCN和DSPP基因均被上調(diào),與相應的BSA組有顯著的統(tǒng)計學差異。體內(nèi)鈣含量測試結(jié)果表明所有BMP-2組的鈣含量均高于相應的BSA組,且25μg BMP-2組的鈣含量顯著高于5μg BMP-2組。由此得出結(jié)論,BMP-2在PL