納米纖維多孔微球支架材料在牙髓牙本質(zhì)組織再生中的應(yīng)用研究.pdf

1、齲病、牙髓病是人類常見的口腔疾病，發(fā)病率高，危害大。目前的治療方法主要是徹底去除病變組織，嚴(yán)密消毒，利用銀汞、復(fù)合樹脂、牙膠等合成的牙科材料充填組織缺損處，達(dá)到修復(fù)病變組織的目的。然而，此類材料只能充填缺損，恢復(fù)一定的牙齒形貌，并不完全具備牙髓牙本質(zhì)組織的生理功能，往往造成牙齒活性降低甚至喪失、變色、脆性增加；長此以往，患者的咀嚼與消化功能也會(huì)受到影響，甚至影響心理發(fā)展和社交活動(dòng)。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為牙本質(zhì)牙髓組織修復(fù)提供了新的契機(jī)，通

2、過種子細(xì)胞、生長因子和支架材料的聯(lián)合應(yīng)用，有望再生具有功能的牙髓牙本質(zhì)組織。支架材料在組織工程再生中起著關(guān)鍵的作用，不僅是種子細(xì)胞的載體，還是種子細(xì)胞的生存微環(huán)境，為目標(biāo)組織的形成構(gòu)建平臺(tái)。對(duì)于再生僅通過狹小根尖孔與外界相通的牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體來說，支架材料的設(shè)計(jì)與選擇顯得尤為重要。理想的支架材料首先應(yīng)該能夠?qū)⒓?xì)胞輸送至不規(guī)則的、微小的組織缺損處，并且應(yīng)當(dāng)能夠?yàn)榧?xì)胞生長、黏附提供良好微環(huán)境,引導(dǎo)細(xì)胞分化形成新生組織。在前期研究中我們應(yīng)用相

3、分離技術(shù)構(gòu)建出具有多孔結(jié)構(gòu)和良好機(jī)械性能的納米左旋聚乳酸（NF-PLLA）支架材料，已成功證實(shí)了其促進(jìn)牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的作用?；诳谇慌R床的應(yīng)用目標(biāo)，可注射式材料更復(fù)合臨床應(yīng)用的需求，因此我們研發(fā)了星狀聚乳酸高分子共聚物，并以此為原材料合成了可注射式納米纖維多孔微球支架材料（NF-SMS），在本研究中我們將人牙髓干細(xì)胞（hDPSCs）接種于NF-SMS支架材料上，檢測NF-SMS對(duì)hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的作用；并進(jìn)一

4、步嘗試將NF-PLLA與NF-SMS聯(lián)合應(yīng)用，復(fù)合hDPSCs構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體；此外，我們還為hDPSCs三維培養(yǎng)自制了低氧裝置，檢測了低氧預(yù)處理對(duì)NF-SMS上的hDPSCs成血管能力的影響，在裸大鼠磨牙牙髓原位修復(fù)模型中獲得了有一定形態(tài)和功能的牙本質(zhì)牙髓樣組織，為進(jìn)一步摸索NF-SMS在牙髓牙本質(zhì)再生的臨床應(yīng)用潛能，提供了有意義的研究基礎(chǔ)。所取得的研究成果如下：
　　1.NF-SMS促進(jìn)hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化

5、和礦化的實(shí)驗(yàn)研究
　　本實(shí)驗(yàn)通過測試hDPSCs在NF-SMS微環(huán)境中的黏附、增殖、分化，摸索應(yīng)用NF-SMS的恰當(dāng)接種比例，檢測hDPSCs在NF-SMS上向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：hDPSCs在NF-SMS微環(huán)境中生長良好，較S-MS和NF-MS環(huán)境增殖快，礦化能力強(qiáng)，堿性磷酸酶（ALP）活性、新生組織鈣含量以及牙本質(zhì)礦化相關(guān)基因表達(dá)明顯上調(diào)，免疫缺陷鼠皮下注射結(jié)果顯示了礦化組織形成，且牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSPP）

6、表達(dá)陽性，進(jìn)一步證明了NF-SMS促進(jìn)hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的作用，提示NF-SMS具有牙本質(zhì)牙髓組織工程臨床應(yīng)用的前景。
　　2.實(shí)驗(yàn)性人工牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的研究
　　本實(shí)驗(yàn)通過NF-PLLA支架材料接種細(xì)胞誘導(dǎo)礦化或者負(fù)載BMP-7緩釋微球，嘗試構(gòu)建牙本質(zhì)樣組織，模擬牙髓再生的外周環(huán)境，進(jìn)而誘導(dǎo)接種于NF-SMS上的hDPSCs分化形成牙髓，最終二者聯(lián)合形成實(shí)驗(yàn)性牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：單獨(dú)的牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)

7、可以通過細(xì)胞接種NF-PLLA支架或者負(fù)載BMP-7緩釋微球獲得，hDPSCs在NF-SMS上復(fù)合后皮下注射獲得血管生長豐富的組織，具有形成牙髓樣結(jié)構(gòu)的潛質(zhì)，但二者機(jī)械結(jié)合并未獲得具有生物活性的牙髓牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，提示我們需要進(jìn)一步探索構(gòu)建牙髓樣組織的微環(huán)境。
　　3.低氧預(yù)處理與NF-SMS聯(lián)合應(yīng)用于牙髓組織工程的實(shí)驗(yàn)研究
　　本實(shí)驗(yàn)建立了一套細(xì)胞三維培養(yǎng)的低氧處理裝置，通過比較不同結(jié)構(gòu)的微球支架材料對(duì)低氧環(huán)境的敏感性，篩選

8、促進(jìn)hDPSCs上調(diào)表達(dá)血管生長因子（VEGF）的材料與表達(dá)VEGF的模式，通過檢測自制低氧裝置與市售低氧倉的細(xì)胞反應(yīng)，確定低氧作用的效果；在篩選出的微球材料中進(jìn)一步觀察低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）和VEGF的表達(dá)關(guān)系與時(shí)間表達(dá)模式，篩選低氧預(yù)處理的條件，再通過皮下注射模型、皮下移植牙模型和裸大鼠原位牙髓再生模型進(jìn)一步求證低氧預(yù)處理促進(jìn)hDPSCs在NF-SMS微環(huán)境中形成牙髓樣組織的可能性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與納米無孔微球、實(shí)體光滑微球相比

9、，納米多孔微球上接種的細(xì)胞對(duì)低氧敏感性高，hDPSCs在低氧環(huán)境下于NF-SMS上表達(dá)HIF-1和VEGF，時(shí)間早，增幅大，持續(xù)數(shù)日，NF-SMS是理想的低氧預(yù)處理細(xì)胞載體；皮下注射低氧預(yù)處理后的hDPSCs與NF-SMS混合物，可以看到低氧預(yù)處理組比常氧預(yù)處理組新生血管更豐富；皮下移植牙模型顯示，牙髓腔內(nèi)新生組織血管豐富，并且在牙本質(zhì)內(nèi)壁檢測到DSPP表達(dá)；裸大鼠原位牙髓修復(fù)模型顯示NF-SMS可以深入根管并降解，為新生組織讓出了空間