抗人CD86雙價(jià)抗體的研制及生物學(xué)活性研究.pdf

1、B7分子是表達(dá)在抗原遞呈細(xì)胞表面的協(xié)同刺激分子，其中 CD86(又稱 B7-2)和CD80(又稱B7-1)為B7分子家族重要成員，為T細(xì)胞活化提供重要的協(xié)同刺激信號。T細(xì)胞的活化不但需要TCR識別抗原肽段所介導(dǎo)的特異性信號，還需要CD28分子結(jié)合抗原提呈細(xì)胞表面B7分子所提供的協(xié)同刺激信號，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖并分化，發(fā)揮正常免疫防御及調(diào)節(jié)功能。
　　有研究表明，B系淋巴瘤細(xì)胞及多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞表面同時(shí)高表達(dá)CD86與CD28，在細(xì)

2、胞間形成交互活化信號，導(dǎo)致此類腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移；進(jìn)一步研究表明，抗體封閉該腫瘤細(xì)胞表面CD86分子可以有效遏制此細(xì)胞的增殖。本研究在已獲得穩(wěn)定分泌抗人CD86單克隆抗體雜交瘤的基礎(chǔ)上，研制抗人CD86雙價(jià)抗體，并研究其對協(xié)同刺激信號的阻斷作用及對表達(dá)CD86的腫瘤細(xì)胞體內(nèi)、外增殖的影響。
　　第一部分，抗人CD86雙價(jià)抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)
　　【目的】：構(gòu)建重組抗人CD86雙價(jià)抗體真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中

3、表達(dá)，分離培養(yǎng)上清，純化CD86-diabody并鑒定其特性。
　　【方法】：從分泌抗人CD86鼠源抗體的雜交瘤1D1中克隆抗體重、輕鏈可變區(qū)基因VH及VL。通過SOE-PCR技術(shù)構(gòu)建VH-(GGGGS)-VL雙價(jià)抗體基因，再整合到真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，F(xiàn)CM篩選G418加壓培養(yǎng)的陽性細(xì)胞克隆。大量培養(yǎng)該CHO細(xì)胞，IMAC法純化細(xì)胞培養(yǎng)上清得到抗體，再用BCA法測定抗體濃度，最后通過SD

4、S-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色鑒定抗體雙價(jià)性。
　　【結(jié)果】：構(gòu)建了抗人CD86-diabody真核表達(dá)載體，篩選出一株具有穩(wěn)定分泌抗人 CD86-diabody能力的 CHO細(xì)胞株，細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗體純品的得率為5.24mg/L，雙價(jià)抗體分子量約為56kDa。
　　【結(jié)論】構(gòu)建了抗人CD86-diabody真核表達(dá)載體，在CHO細(xì)胞中成功表達(dá)，獲得了穩(wěn)定分泌抗人CD86-diabody的CHO細(xì)胞株，大量培養(yǎng)并純化得到了

5、雙價(jià)抗體分子。
　　第二部分，抗人CD86雙價(jià)抗體的生物活性研究
　　【目的】：研究CD86-diabody對細(xì)胞表面CD86分子的特異性識別及介導(dǎo)的生物學(xué)活性。
　　【方法】：通過免疫熒光技術(shù)分析 CD86-diabody對人 B系淋巴瘤細(xì)胞株 Raji及Daudi膜型CD86分子的陽性結(jié)合率，并與抗CD86鼠源親本抗體及單鏈抗體比較抗原結(jié)合特性；通過單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)研究 CD86-diabody對 CD86-C

6、D28協(xié)同刺激信號的阻斷作用；將CD86-diabody加入到Raji細(xì)胞培養(yǎng)體系中進(jìn)行共培養(yǎng)，分析其對Raji細(xì)胞體外增殖的影響，并通過流式細(xì)胞術(shù)研究其對Raji細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用；Raji細(xì)胞經(jīng)CD86-diabody孵育后，接種BALB/c裸鼠，觀察其對腫瘤細(xì)胞體內(nèi)成瘤的影響。
　　【結(jié)果】：CD86-diabody與 Raji及 Daudi細(xì)胞結(jié)合陽性率分別為77.2%及70.6%；競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CD86-diab

7、ody對親本抗體及CD86-scFv與CD86結(jié)合抑制率為69.2%與56.7%；CD86-diabody阻斷協(xié)同刺激信號后，對淋巴細(xì)胞增殖的抑制率為62.9%；CD86-diabody孵育后，Raji細(xì)胞體外增殖率下降了37%，凋亡率增加了17.0%；Raji細(xì)胞經(jīng)CD86-diabody封閉后接種裸鼠，動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤形成延遲6-8天，腫瘤體積較對照組相比小約30%。
　　【結(jié)論】：研制的抗人CD86-diabody能特異性結(jié)