尿路上皮癌患者人巨細(xì)胞病毒活動性感染特異性細(xì)胞免疫狀態(tài)變化的研究.pdf

1、目的:本研究采集尿路上皮癌患者血標(biāo)本進行人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)病原學(xué)檢測,并檢測尿路上皮癌患者外周血單核細(xì)胞的HCMV特異性CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量和比例,計算CD4+/CD8+比值,同時結(jié)合患者臨床資料分析,探討HCMV活動性感染的細(xì)胞免疫狀態(tài)變化與尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展之間的相關(guān)性,為進一步研究尿路上皮癌的病因及發(fā)病機制提供新途徑。
　　方法:隨機采集安徽醫(yī)科大學(xué)第一、

2、第二附屬醫(yī)院泌尿外科隨機采集尿路上皮癌患者的腫瘤組織和外周血標(biāo)本33例,按實驗設(shè)計分別作如下處理:(1)HCMV感染的病原學(xué)檢測:間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血漿中HCMV特異性IgG和IgM抗體;分離外周血白細(xì)胞,接種于人胚成纖維細(xì)胞(HF),觀察CPE(cytopathic effect,CPE);對出現(xiàn)CPE者,采用 RT-PCR檢測 HCMV IE和

3、UL83基因;間接免疫熒光試驗(indirect immunofluorescence assay,IFA)檢測HCMV pp65抗原;分別采用PCR檢測腫瘤組織和血標(biāo)本的HCMV UL55和UL83基因、抗原血癥法檢測血標(biāo)本HCMV pp65抗原,確定標(biāo)本是否有HCMV感染并記錄分析結(jié)果,得到尿路上皮癌患者HCMV感染率。診斷HCMV活動性感染的實驗室證據(jù),包括:①病毒分離,是診斷活動性感染的“金”標(biāo)準(zhǔn);②病毒顆粒和巨細(xì)胞包涵體;③病

4、毒抗原,如基質(zhì)蛋白(pp65)等;④特異性病毒基因(mRNA、DNA):采用PCR法;⑤特異性抗體:雙份血清抗HCMV-IgG滴度≥4倍增高或抗HCMV-IgM陽性有診斷意義。符合上述三點即可判定為HCMV活動性感染。(2)從每份標(biāo)本中分別取0.4ml外周血,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測血中T淋巴細(xì)胞亞群總CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量和比例;運用HCMV pp65 NLVPMVATV九肽-四聚體染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測HCMV特異性C

5、D3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量和比例,并收集患者臨床資料供結(jié)果分析。
　　結(jié)果:(1)HCMV感染的病原學(xué)檢測結(jié)果:間接ELISA檢測血漿中HCMV IgG和IgM抗體,HCMV IgG抗體陽性率為93.9％(31/33);HCMV IgM抗體陽性率為21.2%(7/33);病毒分離:抗凝血白細(xì)胞標(biāo)本接種的HF細(xì)胞經(jīng)盲傳三代出現(xiàn)典型的HCMV CPE,病毒分離率為3.0%(1/33);取該標(biāo)本的細(xì)胞培養(yǎng)物做RT-PCR檢測

6、HCMV IE和UL83基因,該標(biāo)本的HCMV IE和UL83 RT-PCR結(jié)果均為陽性,通過IFA檢測到pp65抗原,證實該血標(biāo)本的細(xì)胞培養(yǎng)物中有HCMV存在,且HCMV IE和UL83基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均為陽性;PCR檢測尿路上皮癌組織的HCMV UL55和UL83基因,陽性率分別為24.2%(8/33)和18.2%(6/33);PCR檢測全血標(biāo)本的HCMV UL55和UL83基因,陽性率分別為27.3%(9/33)和21.2%(7/33

7、);抗原血癥法檢測血標(biāo)本的HCMV pp65抗原,陽性率為18.2%(6/33)?？梢?33例尿路上皮癌患者中HCMV活動性感染率為18.2%。因此,再將33例尿路上皮癌患者分為HCMV活動性感染組(6例)和非HCMV活動性感染組(27例)。
　　(2)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測HCMV總CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞百分比并計算CD4+/CD8+比值。HCMV活動性感染組與非活動性感染組CD3+T淋巴細(xì)胞含量分別為(66.55±

8、3.53)%和(75.68±6.48)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);CD4+T淋巴細(xì)胞含量分別為(26.52±4.95)%和(43.54±6.76)%,統(tǒng)計學(xué)差異有顯著性(P<0.01);HCMV活動性感染組與非 HCMV活動性感染組CD8+T淋巴細(xì)胞含量分別為(37.25±4.01)%和(29.76±8.26)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);HCMV活動性感染組與非活動性感染組 CD4+/CD8+比值分別為(0.73±0

9、.18)和(1.62±0.63),統(tǒng)計學(xué)差異有顯著性(P<0.01)?？梢?與非 HCMV活動性感染組比較,HCMV活動性感染組CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞含量及CD4+∕CD8+比例均有下降,CD8+T淋巴細(xì)胞含量升高。運用HCMV pp65 NLVPMVATV九肽-四聚體染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測HCMV特異性CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的百分比并計算CD4+/CD8+比值:HCMV活動性感染組特異性CD3+淋巴細(xì)胞含量低于非

10、HCMV活動性感染組, HCMV特異性 CD3+T淋巴細(xì)胞含量分別為(64.67±5.47)%和(73.10±5.34)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05);HCMV活動性感染組特異性 CD4+淋巴細(xì)胞含量顯著低于非HCMV活動性感染組,HCMV特異性CD4+T淋巴細(xì)胞含量分別為(24.25±3.90)%和(45.67±6.28)%,統(tǒng)計學(xué)差異有顯著性(P﹤0.01); HCMV活動性感染組特異性CD8+淋巴細(xì)胞含量顯著高于非HCMV活

11、動性感染組,HCMV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞含量分別為(39.08±5.80)%和(25.17±7.59)%,統(tǒng)計學(xué)差異有顯著性(P﹤0.01);HCMV活動性感染組特異性CD4+∕CD8+比例顯著低于非HCMV活動性感染組,HCMV特異性CD4+∕CD8+比例分別為(0.64±0.16)%和(1.95±0.59)%,統(tǒng)計學(xué)差異有顯著性(P﹤0.01)。
　　(3)分析本次研究的尿路上皮癌患者的臨床資料發(fā)現(xiàn):年齡高于50歲的尿路上

12、皮癌患者出現(xiàn)HCMV活動性感染的比例高于年齡低于50歲的尿路上皮癌患者,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)尿路上皮癌復(fù)發(fā)者出現(xiàn)HCMV活動性感染的比例高于尿路上皮癌初發(fā)者,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);尿路上皮癌伴隨出現(xiàn)腰痛癥狀者出現(xiàn)HCMV活動性感染的比例高于無癥狀者,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);年齡高于50歲的尿路上皮癌患者出現(xiàn)HCMV特異性細(xì)胞免疫狀態(tài)異常的比例高于年齡低于50歲的尿路上皮癌患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P

13、<0.05);尿路上皮癌復(fù)發(fā)者出現(xiàn)HCMV特異性細(xì)胞免疫狀態(tài)異常的比例高于尿路上皮癌初發(fā)者,統(tǒng)計學(xué)差異有顯著性(P<0.01)。尿路上皮癌的病理分級與HCMV活動性感染相關(guān),HCMV活動性感染者病理分級升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:(1)對33例尿路上皮癌患者HCMV活動性感染率為18.2%。結(jié)合HCMV活動性感染情況分析臨床資料表明,年齡高于50歲的尿路上皮癌患者出現(xiàn)HCMV活動性感染的可能性更高,且HCM

14、V活動性感染的尿路上皮癌患者更容易出現(xiàn)尿路上皮癌復(fù)發(fā)以或腰痛癥狀,尿路上皮癌患者隨病理分級程度的升高,發(fā)生HCMV活動性感染的幾率增加?？梢?HCMV活動性感染與復(fù)發(fā)尿路上皮癌的發(fā)生有相關(guān)性。
　　(2)與非HCMV活動性感染組比較,HCMV活動性感染組總CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞比例及CD4+∕CD8+比值均有下降,CD8+T細(xì)胞比例升高;而HCMV活動性感染組特異性CD3+、CD4+T細(xì)胞的比例及CD4+/CD8+比值降低,

15、CD8+T細(xì)胞比例升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此可判斷,HCMV活動性感染與尿路上皮癌患者HCMV特異性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答狀態(tài)改變有關(guān),特別是與HCMV特異性CD3+、CD4+和CD8+ T細(xì)胞的免疫應(yīng)答狀態(tài)密切相關(guān)。
　　(3)結(jié)合細(xì)胞免疫狀態(tài)分析臨床資料表明,HCMV活動性感染的尿路上皮癌患者在臨床上出現(xiàn)異常癥狀與HCMV特異性細(xì)胞免疫狀態(tài)異常有關(guān),特別是年齡越大的尿路上皮癌復(fù)發(fā)者更容易出現(xiàn)HCMV活動性感染,同

16、時導(dǎo)致HCMV特異性細(xì)胞免疫狀態(tài)異常。尤其是在結(jié)合臨床資料和細(xì)胞免疫狀態(tài)分析HCMV臨床分離陽性的尿路上皮癌患者時發(fā)現(xiàn),該例患者為HCMV活動性感染,尿路上皮癌為復(fù)發(fā),病理分級為高級別,在臨床上出現(xiàn)腰痛、尿血、尿頻、尿急和尿痛癥狀,且HCMV特異性細(xì)胞免疫狀態(tài)和HCMV非特異性細(xì)胞免疫狀態(tài)均為異常狀態(tài)。由此可見,尿路上皮癌患者HCMV活動性感染可能是導(dǎo)致尿路上皮癌復(fù)發(fā)的重要因素之一,同時對尿路上皮癌患者的細(xì)胞免疫系統(tǒng)功能有明顯抑制作用。