冬凌草甲素聯(lián)合柔紅霉素對(duì)jurkat細(xì)胞的增殖抑制作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的；冬凌草甲素(Oridonin)是一種從冬凌草植物(Rabdosa rubescens)中提取出來的具有生物學(xué)活性的四環(huán)二帖類化合物，研究發(fā)現(xiàn)它具有抗炎、抗菌和抗腫瘤的功效，冬凌草甲素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有不同程度的抑制作用，但對(duì)急性T淋巴細(xì)胞白血病的研究鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用急性T淋巴細(xì)胞白血病jurkat細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)研究的對(duì)象，探討冬凌草甲素(oridonin)單用及聯(lián)合柔紅霉素(DNR)對(duì)jurkat細(xì)胞的增殖抑制、促凋亡作用并對(duì)

2、冬凌草甲素誘導(dǎo)jurkat細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究進(jìn)行初步的探討，為臨床治療急性T淋巴細(xì)胞白血病的新藥開發(fā)利用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：采用CCK-8檢測(cè)冬凌草甲素單用及聯(lián)合化療藥物柔紅霉素作用于jurkat細(xì)胞24h、48h、72h后的增殖抑制作用；利用相差顯微鏡、Giemsa染色、羅丹明123熒光染色觀察冬凌草甲素作用于jurkat細(xì)胞48h后的形態(tài)學(xué)變化；AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)冬凌草甲素單用及聯(lián)合化療

3、藥物柔紅霉素作用于jurkat細(xì)胞48h后凋亡的影響；為進(jìn)一步明確冬凌草甲素誘導(dǎo)jurkat細(xì)胞凋亡的部分作用機(jī)制，在第二部分實(shí)驗(yàn)中采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)冬凌草甲素作用于jurkat細(xì)胞48h后的周期分布變化；羅丹明123檢測(cè)冬凌草甲素作用于jurkat細(xì)胞48h后的熒光強(qiáng)度；caspase-3酶活性檢測(cè)冬凌草甲素作用于jurkat細(xì)胞48h后的caspase-3酶活性變化。
　　 結(jié)果：⑴CCK-8試劑盒檢測(cè)表明相同時(shí)間下，隨著藥

4、物濃度的增加，吸光度值逐漸降低；相同藥物濃度下，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度值逐漸減低，表明冬凌草甲素對(duì)jurkat細(xì)胞的作用呈現(xiàn)一定的劑量-時(shí)間依賴性。取對(duì)jurkat細(xì)胞抑制作用最弱的1ug/ml柔紅霉素聯(lián)合不同濃度的冬凌草甲素共同作用于jurkat細(xì)胞，其抑制作用高于單用柔紅霉素及冬凌草甲素，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，金氏公式判斷冬凌草甲素聯(lián)合柔紅霉素對(duì)jurkat細(xì)胞具有協(xié)同抑制效應(yīng)。⑵相差顯微鏡下，隨著藥物濃度的增加

5、，細(xì)胞密度逐漸減低，邊緣不清，亮度逐漸減弱，呈現(xiàn)膜皺縮、核破裂等溶解性壞死等變化；Giemsa染色觀察空白對(duì)照組細(xì)胞邊緣光滑，染色質(zhì)紫紅色，伴隨藥物濃度的增加，胞膜皺縮，細(xì)胞核邊集，空泡變性、染色質(zhì)密集濃染，部分觀察到凋亡小體等凋亡形態(tài)學(xué)變化；羅丹明123染色觀察隨著藥物濃度的增加，jurkat細(xì)胞呈現(xiàn)胞體萎縮，細(xì)胞熒光染色強(qiáng)度減弱等表現(xiàn)。⑶流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：不同濃度的冬凌草甲素(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/

6、ml、16μg/ml)處理組作用于jurkat細(xì)胞48h后的凋亡率分別為7.74±0.96％、13.26±1.49％、17.42±1.24％、25.13±2.12％、29.07±0.59％，與空白對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，柔紅霉素最低誘導(dǎo)凋亡濃度(0.04μg/ml)聯(lián)合接近IC50濃度的冬凌草甲素(4μg/ml)共同作用于jurkat細(xì)胞48h，其凋亡率明顯高于單用柔紅霉素、冬凌草甲素的凋亡率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑷流式細(xì)胞儀檢測(cè)

7、表明：不同濃度的冬凌草甲素(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml)處理組作用于jurkat細(xì)胞48h后，隨著藥物濃度的增加，G1期細(xì)胞比例分別為33.96±1.15％、36.04±0.30％、37.05±0.18％、37.59±0.76％、38.77±1.58％、47.71±4.94％，其中8μg/ml、16μg/ml冬凌草甲素處理組與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；S期細(xì)胞呈減少趨

8、勢(shì)，各濃度處理組與空白對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)表明冬凌草甲素影響細(xì)胞周期分布，可誘導(dǎo)jurkat細(xì)胞阻滯于G1期。⑸FCM檢測(cè)表明：隨著藥物濃度的增加，熒光強(qiáng)度呈濃度依賴性降低，各濃度處理組的熒光強(qiáng)度分別為3806.79±186.30、3516.43±223.86、3072.41±28.52、665.82±85.39、193.08±3.70，與空白對(duì)照組相比，除第一處理組外，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=302.

9、584，P<0.05)，實(shí)驗(yàn)表明冬凌草甲素可誘導(dǎo)jurkat細(xì)胞膜電位降低，是冬凌草甲素誘導(dǎo)jurkat細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。⑹不同濃度的冬凌草甲素(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml)處理組作用于jurkat細(xì)胞48h后，隨著藥物濃度的增加，吸光度值分別為0.162±0.005、0.169±0.004、0.179±0.015、0.190±0.008、0.203±0.155與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)

10、學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)表明隨著藥物濃度增加吸光度值呈現(xiàn)濃度依賴性增加，間接反映caspase-3酶活性逐漸增高。
　　 結(jié)論：①冬凌草甲素對(duì)iurkat細(xì)胞具有增殖抑制作用，該作用具有一定的時(shí)間-劑量依賴性；當(dāng)冬凌草甲素聯(lián)合化療藥物柔紅霉素時(shí)對(duì)jurkat細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用，提示冬凌草甲素本身可作為一種新型抗腫瘤藥物在抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)其凋亡的同時(shí)，還可以作為化療藥物的輔助用藥，增強(qiáng)化療藥物對(duì)白血病細(xì)胞的敏感性、降低用藥量及其副作

11、用。②冬凌草甲素對(duì)jurkat細(xì)胞的殺傷作用主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的，其機(jī)制主要如下：影響細(xì)胞周期分布，將細(xì)胞阻滯于G1期，周期阻滯作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，從而有效控制細(xì)胞增殖；線粒體跨膜電位(△Ψm)的降低呈一定的劑量依賴性，其降低程度反映線粒體膜受損的程度，是細(xì)胞凋亡的早期事件，反映細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡程序；Caspase-3是caspase蛋白家族執(zhí)行細(xì)胞凋亡的最強(qiáng)大凋亡效應(yīng)因子及最終凋亡執(zhí)行者，激活caspase-3酶活性