磁性溫敏凝膠作為卡介苗載體在膀胱腫瘤灌注治療中的應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景:
　　膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率較高。膀胱癌包括尿路上皮癌、鱗狀細(xì)胞癌和腺細(xì)胞癌，其中尿路上皮癌最為常見，雖然理論上經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)可完全切除非肌層浸潤性膀胱癌，但術(shù)后復(fù)發(fā)率可高達(dá)67％。因此中國、歐洲及美國的泌尿外科指南建議所有非肌層浸潤性膀胱癌患者術(shù)后均應(yīng)進(jìn)行輔助性膀胱灌注治療?？ń槊纾˙acillus Calmette-Guérin，BCG）是膀胱灌注常用的一種生物制劑，為一種減毒活菌，具有一

2、定的抗原性、致敏性和殘余毒性。經(jīng)過多年的實(shí)踐，BCG已被公認(rèn)為最有效的預(yù)防膀胱腫瘤復(fù)發(fā)的免疫制劑，適用于表淺的、非肌層浸潤性膀胱腫瘤的術(shù)后灌注治療。
　　BCG膀胱灌注雖然療效確切，但其不良反應(yīng)發(fā)生率較高，限制了其臨床應(yīng)用。且有研究報(bào)道，30～50％的膀胱腫瘤病人BCG灌注失敗，因無法耐受副作用、對(duì)BCG治療反應(yīng)差、腫瘤進(jìn)展或復(fù)發(fā)等，最終停用BCG灌注治療。增加BCG的灌注劑量是增強(qiáng)BCG治療反應(yīng)的最直接方法，但矛盾的是BCG灌注

3、的劑量越大，雖然抗腫瘤效果明顯，但副作用隨之增加，如何提高BCG的療效同時(shí)降低其不良反應(yīng)，成為研究的熱點(diǎn)。
　　由于人周期性的排尿，藥物灌注后很快隨尿液排出體外，其與膀胱粘膜的作用時(shí)間較短，通常只有1～2小時(shí)。藥物膀胱內(nèi)灌注后，在較短的時(shí)間段內(nèi)，病人對(duì)膀胱內(nèi)藥物的反應(yīng)個(gè)體差異較大，部分病人甚至沒有反應(yīng)。膀胱內(nèi)藥物灌注的效果主要與膀胱內(nèi)藥物濃度及持續(xù)時(shí)間相關(guān)，而非藥物灌注劑量。因此，BCG灌注后在膀胱內(nèi)的持續(xù)作用時(shí)間對(duì)治療效果至關(guān)重

4、要。
　　基于殼聚糖(CS)及β-甘油磷酸鈉(β-glycerophosphate，GP)的溫敏凝膠是一種生物材料，在室溫條件下，CS和GP的混合溶液呈液態(tài)，加熱至37℃體溫條件下，即轉(zhuǎn)變?yōu)镃S/GP凝膠。CS凝膠在藥物載體、細(xì)胞包裹及組織工程等方面得到廣泛應(yīng)用，是優(yōu)良且極具發(fā)展前途的醫(yī)用緩釋體系。因此我們?cè)O(shè)想，CS/GP溫敏凝膠可以裝載BCG進(jìn)行膀胱灌注，以期延長(zhǎng)BCG在膀胱內(nèi)的滯留時(shí)間，提高BCG的療效。
　　CS/GP

5、溫敏凝膠載體進(jìn)入膀胱后依然會(huì)隨尿液排出體外。我們?cè)O(shè)想利用磁性顆粒及外加磁場(chǎng)防止凝膠載體隨尿液排出。Fe3O4磁性納米粒(Fe3O4 magnetic nanoparticle，F(xiàn)e3O4-MNP)是一種納米級(jí)鐵氧體，具有磁響應(yīng)性好，在液體中可均勻分散，且在生物體內(nèi)可被降解，無毒副作用等特性，作為磁性材料在生物領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。因此我們將Fe3O4-MNP包裝進(jìn)入CS/GP溫敏凝膠內(nèi)，在外加磁場(chǎng)條件下，利用Fe3O4-MNP所提供的磁牽

6、引力，實(shí)現(xiàn)凝膠載體在膀胱內(nèi)的貼壁粘附。
　　研究目的:
　　本課題中我們以CS/GP凝膠為基質(zhì)，設(shè)計(jì)了一種搭載BCG、Fe3O4-MNP的載體復(fù)合物（Fe3O4-BCG-CS/GP），在常溫條件下為液體，進(jìn)入體內(nèi)后可轉(zhuǎn)變?yōu)槟z，用以進(jìn)行BCG的膀胱灌注，以期延長(zhǎng)BCG在膀胱內(nèi)的作用時(shí)間，并最終增強(qiáng)BCG的抗膀胱腫瘤作用。
　　方法:
　　1.Fe3O4-BCG-CS/GP凝膠載體系統(tǒng)的構(gòu)建、表征檢測(cè)及體內(nèi)應(yīng)用可行

7、性評(píng)估
　　1.1、Fe3O4-BCG-CS/GP載體復(fù)合物的制備
　　根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道及我們的前期實(shí)驗(yàn)，制備方法如下:
　　1)將脫乙酰度為95％的CS溶于0.1mol/L的稀鹽酸中;
　　2)室溫下持續(xù)充分?jǐn)嚢?小時(shí);
　　3)將CS溶液中不溶性顆粒過濾;
　　4)將β-GP粉末溶于蒸餾水中;
　　5)將CS溶液及β-GP溶液在4℃冰箱中冷藏10分鐘;
　　6)持續(xù)攪拌的狀態(tài)下將β-G

8、P溶液逐滴加入CS溶液中，直至形成均一的溶液;
　　7)然后將一定量的BCG及Fe3O4-MNP加入混合溶液中，采用機(jī)械攪拌、超聲分散的方法混合均勻;
　　1.2、CS/GP溶液及Fe3O4-BCG-CS/GP復(fù)合物溶液的體外凝膠化時(shí)間測(cè)定
　　不同濃度配比的CS/GP溶液及Fe3O4-BCG-CS/GP載體復(fù)合物凝膠化時(shí)間的測(cè)定按照如下經(jīng)典方法進(jìn)行:
　　將溶液加入離心管中;37℃水浴鍋中加熱;按照一定的時(shí)間間

9、隔，從水浴鍋中取出離心管，倒置觀察;倒置30s樣品不流動(dòng)，即可認(rèn)為凝膠化完成;記錄不同CS和GP配比的CS/GP溶液凝膠化時(shí)間，F(xiàn)e3O4-BCG-CS/GP載體復(fù)合物溶液凝膠化時(shí)間同理測(cè)定。
　　1.3、大鼠體內(nèi)凝膠化時(shí)間測(cè)定及冰凍切片檢查
　　利用大鼠測(cè)定體內(nèi)凝膠化時(shí)間。灌注前，進(jìn)行腹腔注射麻醉，取3Fr硬膜外導(dǎo)管自制大鼠導(dǎo)尿管。用空針抽出大鼠膀胱內(nèi)尿液。將0.1mlFe3O4-BCG-CS/GP載體復(fù)合物溶液注入大鼠膀

10、胱內(nèi)。根據(jù)步驟2中測(cè)定的凝膠化時(shí)間，處死大鼠，取出膀胱，觀察凝膠化完成情況。然后對(duì)大鼠膀胱進(jìn)行冰凍切片檢查，觀察復(fù)合物凝膠后的形態(tài)。
　　1.4、數(shù)碼顯微鏡及掃描電鏡檢查
　　我們采用數(shù)碼顯微鏡及掃描電鏡來觀察Fe3O4-BCG-CS/GP復(fù)合物凝膠的表面形態(tài)。Fe3O4-BCG-CS/GP復(fù)合物溶液在37℃水浴中完成凝膠化。取樣品少量冷凍干燥。放置于數(shù)碼顯微鏡下觀察攝片。噴鍍貴金屬銀，增強(qiáng)導(dǎo)電性，處理完成后在掃描電鏡下觀察

11、復(fù)合物凝膠的表面形態(tài)。
　　1.5Fe3O4-BCG-CS/GP復(fù)合物凝膠大鼠膀胱內(nèi)滯留時(shí)間測(cè)定
　　雌性Wistar大鼠36只用以測(cè)定Fe3O4-BCG-CS/GP復(fù)合物凝膠在膀胱內(nèi)的滯留時(shí)間。大鼠膀胱灌注前2小時(shí)禁飲。麻醉后進(jìn)行膀胱灌注，所有大鼠處于4kG外加磁場(chǎng)中飼養(yǎng)。灌注后每4小時(shí)處死大鼠3只;取膀胱標(biāo)本立即進(jìn)行冰凍切片檢查，HE染色觀察膀胱內(nèi)殘留凝膠形態(tài)，抗酸染色及復(fù)染HE染色觀察凝膠中剩余BCG的形態(tài)。
　

12、　2.Fe3O4-BCG-CS/GP凝膠載體系統(tǒng)抗膀胱腫瘤作用的研究
　　2.1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
　　本部分實(shí)驗(yàn)使用24只雌性Wistar大鼠。根據(jù)以往成熟的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用BBN誘發(fā)大鼠膀胱腫瘤原位模型后進(jìn)行抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。BBN加入每日飲水中，濃度為0.05％，共喂養(yǎng)8周。10周后，24只大鼠根據(jù)灌注藥物的不同隨機(jī)分為4組:
　　第一組(Group1):為對(duì)照組，給予0.1ml的PBS灌注;
　　第二組(Group2):

13、給予1mg/0.1ml的BCG進(jìn)行膀胱灌注;
　　第三組(Group3):CS/GP溶液灌注組，每次灌注0.1ml;
　　第四組(Group4):給予Fe3O4-BCG-CS/GP復(fù)合物溶液0.1ml，含1mgBCG。
　　四組大鼠每周灌注一次，共6次。實(shí)驗(yàn)的1～8周為腫瘤誘導(dǎo)期，11～16周為治療期。四組大鼠均飼養(yǎng)于強(qiáng)度為4kG的磁場(chǎng)環(huán)境中。
　　2.2、抗腫瘤效果驗(yàn)證
　　20周后麻醉下處死所有大鼠，收

14、集大鼠膀胱組織觀察。詳細(xì)記錄每只大鼠的腫瘤數(shù)目及每個(gè)腫瘤的體積，計(jì)算每組大鼠的腫瘤發(fā)生率及每只大鼠的平均腫瘤體積。直徑超過0.5mm的腫物擬定為腫瘤，列入統(tǒng)計(jì)中。腫瘤體積按如下公式計(jì)算:V(mm3)=1/2×a×b2（a是腫瘤的最大直徑，b為腫瘤的最短直徑）。
　　2.3、尿液細(xì)胞因子分析
　　膀胱灌注后，將4組大鼠轉(zhuǎn)移至代謝籠內(nèi)收集尿液。第一次膀胱灌注后24小時(shí)收集尿液，每日收集1次，共6次。按實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，在處死大鼠前收集尿

15、液1次。每次收集的時(shí)間約2小時(shí)。收集尿液的離心管內(nèi)含蛋白酶抑制劑，收集時(shí)放置于冰塊上。收集完成后離心、儲(chǔ)存于-80℃冰箱中待檢。本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ELISA法來檢測(cè)大鼠尿液中IL-2和IFN-γ的濃度，描繪出其變化曲線。通過計(jì)算曲線下面積(area under the curve，AUC)來估算大鼠接受單次膀胱灌注后尿液中細(xì)胞因子分泌的總量，據(jù)此評(píng)估大鼠膀胱內(nèi)免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱。
　　2.4、免疫組化檢查
　　大鼠膀胱灌注BC

16、G后引起膀胱內(nèi)CD4+的淋巴細(xì)胞浸潤，其在BCG抗膀胱腫瘤的作用機(jī)制中起重要作用。處死所有大鼠后，收集大鼠膀胱組織進(jìn)行免疫組化檢查。我們采用CD4抗體免疫組化染色的方法檢測(cè)膀胱粘膜中浸潤的CD4+淋巴細(xì)胞。
　　2.5、統(tǒng)計(jì)分析
　　所有數(shù)據(jù)讀取等檢測(cè)步驟重復(fù)進(jìn)行三遍，指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用Prism5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)值以(x)±s表示，根據(jù)需要選用配對(duì)資料的t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選用雙側(cè)檢驗(yàn)。P＜0

17、.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.Fe3O4-BCG-CS/GP凝膠載體系統(tǒng)的構(gòu)建、表征檢測(cè)及體內(nèi)應(yīng)用可行性評(píng)估
　　實(shí)驗(yàn)所制備的CS/GP溶液無色半透明狀，性質(zhì)均一，在體外加熱至37℃的條件下，CS/GP溶液成功完成凝膠化，凝膠化后溶液失去流動(dòng)性。傾倒離心管，凝膠固定不流動(dòng)。Fe3O4-BCG-CS/GP復(fù)合物成功完成凝膠化，樣品呈灰黑色，性質(zhì)均一。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CS及GP的濃度皆可影響凝膠化時(shí)間。由于復(fù)合

18、物凝膠中Fe3O4-MNP的存在，凝膠保留了一定的磁響應(yīng)性。經(jīng)冰凍切片、HE染色后觀察，F(xiàn)e3O4-BCG-CS/GP載體復(fù)合物亦在大鼠膀胱內(nèi)完成凝膠化。由于CS為有機(jī)物，冰凍切片法較好地保留了復(fù)合物凝膠在膀胱內(nèi)的形態(tài)，顯示Fe3O4-BCG-CS/GP復(fù)合物凝膠載體呈網(wǎng)格狀的微結(jié)構(gòu)，大小、直徑不一。數(shù)碼顯微鏡及電鏡下可觀察到復(fù)合物凝膠的表面同樣呈現(xiàn)大小不同的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，與冰凍切片所示結(jié)構(gòu)相似。在磁場(chǎng)作用下，復(fù)合物凝膠在膀胱內(nèi)貼附到膀胱

19、壁表面。隨著復(fù)合物凝膠在膀胱內(nèi)作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其在粘膜表面的降解增多、隨尿液排出的損耗增大以及尿液的溶蝕作用，其濃度和密度也逐漸降低，凝膠網(wǎng)格溶脹擴(kuò)大，網(wǎng)格壁變薄。經(jīng)過48小時(shí)，我們?nèi)钥稍诎螂變?nèi)檢測(cè)到少量凝膠存留，因此我們可以認(rèn)為，磁性凝膠作為BCG載體，可以在外加磁場(chǎng)的作用下，在膀胱內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng)達(dá)48個(gè)小時(shí)。
　　2.Fe3O4-BCG-CS/GP凝膠載體系統(tǒng)抗膀胱腫瘤作用的研究
　　在抗大鼠膀胱腫瘤的研究中，大鼠灌注Fe

20、3O4-BCG-CS/GP復(fù)合物后，所有24只大鼠均按計(jì)劃完成20周的實(shí)驗(yàn)過程。在第20周末，處死大鼠，取大鼠膀胱組織進(jìn)行檢查。Fe3O4-BCG-CS/GP復(fù)合物與普通BCG都顯示出明顯抗腫瘤誘導(dǎo)作用。Fe3O4-BCG-CS/GP復(fù)合物組大鼠的平均腫瘤體積較BCG組大鼠明顯減小，但在腫瘤數(shù)目方面的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Fe3O4-BCG-CS/GP復(fù)合物灌注后大鼠尿液中IL-2及IFN-γ濃度較普通BCG組明顯升高，且分泌總量較大。通

21、過CD4染色，F(xiàn)e3O4-BCG-CS/GP復(fù)合物灌注的大鼠膀胱粘膜下有更多CD4+淋巴細(xì)胞浸潤。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)中成功制備了以CS/GP溫敏凝膠為載體、以Fe3O4-MNP為磁性牽引物、搭載BCG的Fe3O4-BCG-CS/GP凝膠載體系統(tǒng)，經(jīng)驗(yàn)證可在體內(nèi)、體外成功完成凝膠化，保留了較好的磁響應(yīng)性。凝膠載體呈網(wǎng)格狀，BCG等搭載物在凝膠載體中相對(duì)獨(dú)立，利于BCG的釋放。Fe3O4-BCG-CS/GP凝膠載體系統(tǒng)在外

22、加磁場(chǎng)作用下，可在大鼠膀胱內(nèi)延長(zhǎng)BCG的作用時(shí)間達(dá)48小時(shí);動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，與普通BCG相比，同等劑量條件下Fe3O4-BCG-CS/GP凝膠載體所搭載的BCG可刺激膀胱分泌更多細(xì)胞因子，募集大量炎性細(xì)胞浸潤，在膀胱內(nèi)產(chǎn)生更強(qiáng)的粘膜免疫反應(yīng)，其抗膀胱腫瘤作用優(yōu)于普通BCG。我們認(rèn)為以CS/GP溫敏凝膠為載體搭載Fe3O4-MNP、BCG后構(gòu)建的Fe3O4-BCG-CS/GP凝膠載體系統(tǒng)，增強(qiáng)了BCG的免疫活性及抗腫瘤效應(yīng)，為BCG的應(yīng)用提