膿毒癥性急性肺損傷大鼠細胞因子調(diào)控變化及復(fù)方清下湯對其影響.pdf

1、背景及目的：膿毒癥多繼發(fā)于嚴重感染、創(chuàng)傷、休克和大手術(shù)后，是由于局部或全身感染等因素所導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合癥（SIRS）。發(fā)展到晚期的膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征（MODS）是該癥的主要死亡原因，也是臨床上危重病中最常見的死亡原因。膿毒癥病情進展迅速，是臨床醫(yī)學(xué)中一種難治的綜合征。目前關(guān)于膿毒癥的研究多集中于對某些臟器以及對不同時期各種炎性因子的研究。 膿毒癥在創(chuàng)傷和感染等應(yīng)激狀態(tài)下，腸道的屏障功能受損，腸道內(nèi)大量的細菌和

2、內(nèi)毒素經(jīng)門靜脈及淋巴系統(tǒng)侵入血液循環(huán)，造成腸源性感染和毒性網(wǎng)絡(luò)，引起全身多器官功能衰竭。急性肺損傷（ALI）發(fā)生早、病情嚴重，常是病人死亡的直接原因。ALI是以通透性肺水腫為特征的一種臨床綜合征，其嚴重階段即是急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）； ARDS是多種原因引起的肺部失控性炎癥反應(yīng)的結(jié)果，而革蘭氏陰性桿菌內(nèi)毒素（LPS）介導(dǎo)炎癥細胞產(chǎn)生釋放大量細胞因子和炎性介質(zhì)在ARDS的發(fā)病過程中起關(guān)鍵性作用，但ARDS發(fā)病機制尤其是肺水腫的形成

3、機制仍未闡明清楚。 腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、細胞間粘附分子-1（ICAM-1）、水通道蛋白（AQPs）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等諸因素均可能與水腫的發(fā)生有關(guān)，但是其內(nèi)在相互關(guān)系及調(diào)控并不完全清楚。 腫瘤壞死因子（TNF），包括TNF-α和TNF-β。TNF-α又稱為惡液質(zhì)因子，是介導(dǎo)內(nèi)毒素休克、SIRS、急性肺損傷（ALI）和多器官功能障礙綜合征（MODS）

4、的重要起始因子，可誘導(dǎo)其它多種因子的產(chǎn)生，這些促炎癥細胞因子之間相互作用可形成許多正反饋環(huán)，導(dǎo)致所謂炎癥“級聯(lián)效應(yīng)”的發(fā)生。 細胞間粘附分子-1（ICAM-1）又名CD54。研究發(fā)現(xiàn)其參與許多炎癥性疾病過程。其可能介導(dǎo)肺微血管內(nèi)皮細胞，多形核粒細胞（PMVEC-PMN）的粘附，導(dǎo)致PMN肺微血管內(nèi)的扣押，微血栓形成和血管內(nèi)皮損傷，引起血管通透性增加，形成肺水腫，進而導(dǎo)致ALI。 水通道蛋白（AQPs），其主要功能是介導(dǎo)自

5、由水的跨細胞膜轉(zhuǎn)運。肺組織中主要有4種水通道蛋白的表達，其中AQP-1主要定位于肺微血管內(nèi)皮，對于維持血管與間質(zhì)之間的水運動平衡意義重大。 MAPK是蛋白激酶家族成員，其中p38通路與炎癥反應(yīng)的調(diào)控密切相關(guān)，在許多細胞因子如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。研究顯示p38可促進ICAM-1的表達。p38可由TNF-α、IL-1等誘導(dǎo)刺激而激活，而TNF-α、IL-1、IL-6以及IL-8又是p38依賴性的。 膿毒癥過程所引起的急性

6、肺損傷（ALI）與上述基因表達調(diào)控的相關(guān)性研究較少，并且未見在同一感染模型下對上述基因表達調(diào)控的平行研究，亦未見復(fù)方清下湯的相關(guān)治療性研究的報道。本課題擬以盲腸結(jié)扎穿孔導(dǎo)致大腸桿菌腹膜炎，進而誘發(fā)膿毒癥肺損傷為模型，檢測炎性反應(yīng)時上述基因的調(diào)控變化，探討肺水腫的形成機制，調(diào)控機制及復(fù)方清下湯、p38抑制劑對肺損傷的作用，以期為膿毒癥以及多器官功能衰竭綜合癥（MODS）的防治提出可能的新途徑。 方法: 實驗一：將健康SD大

7、鼠隨機分為4組，每組10只：假手術(shù)組（SHAM組），SHAM組只翻動盲腸，不做其他處理；膿毒癥肺損傷組（模型組），以盲腸結(jié)扎穿孔誘發(fā)ALI模型；盲腸結(jié)扎穿孔+復(fù)方清下湯組（造模后立即灌胃給藥，造模后8小時再次灌胃1次，劑量：10 ml/kg）；盲腸結(jié)扎穿孔+頭孢派酮舒巴坦組（抗生素舒普深）（造模后立即靜脈注射1次，造模后8小時再次靜脈注射1次，劑量：0.2g/kg）造模24h后收集標(biāo)本。分別觀察大鼠的一般狀態(tài)，肺組織勻漿MPO的測定，留

8、取下腔靜脈血清進行TNF-α、IL-1、IL-6的測定。鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變，測量肺濕/干比值的變化。 實驗二：將健康SD大鼠隨即分為4組，每組10只：（1）假手術(shù)組（SHAM組），SHAM組只翻動盲腸，不做其他處理；（2）膿毒癥肺損傷組（模型組），以盲腸結(jié)扎穿孔誘發(fā)ALI模型；（3）盲腸結(jié)扎穿孔+復(fù)方清下湯組（造模后立即灌胃給藥，造模后8小時再次灌胃1次，劑量：10 ml/kg）；（4）盲腸結(jié)扎穿孔+頭孢派酮舒巴坦（抗

9、生素舒普深）（造模后立即靜脈注射1次，造模后8小時再次靜脈注射1次，劑量：0.2 g/kg）造模24h后收集標(biāo)本。應(yīng)用免疫組織化學(xué)和western blot方法檢測肺組織中TNF-α、 IL-1、 IL-6、AQP-1、ICAM-1以及p38的表達，RT-PCR法檢測肺組織上述蛋白mRNA表達。 實驗三：將健康SD大鼠隨機分為4組，每組10只：（1）假手術(shù)組（SHAM組），SHAM組只翻動盲腸，不做其他處理；（2）膿毒癥肺損傷組

10、（模型組），以盲腸結(jié)扎穿孔誘發(fā)ALI模型；（3）盲腸結(jié)扎穿孔+復(fù)方清下湯組（造模后立即灌胃給藥，造模后8小時再次灌胃1次，劑量：10 ml/kg）；（4）p38抑制劑處理組，在動物模型組制備前30分鐘灌胃給予SB203580（12.5 mg/kg）。應(yīng)用免疫組織化學(xué)和western blot法方法檢測肺組織中TNF-α、IL-1、IL-6、ICAM-1的表達。采用RT-PCR法檢測肺組織上述蛋白mRNA表達。 結(jié)果: 1

11、.實驗一：與SHAM組比較，模型組MPO、TNF-α、IL-1、IL-6水平明顯升高，肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)水腫，伴大量紅細胞滲出（出血）和纖維素沉積，肺泡間隔毛細血管內(nèi)皮細胞高度腫脹。肺濕/干比值明顯增加，抗生素及中藥處理組與模型組比較，MPO、TNF-α、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）水平明顯降低，肺濕/干比值明顯降低，肺組織鏡下表現(xiàn)：抗生素處理組、中藥處理組較模型組，肺泡間隔變窄，毛細血管內(nèi)皮細胞腫脹減輕，出血明顯減少，纖

12、維素滲出相對減少。 2.實驗二：與SHAM組比較，模型組應(yīng)用免疫組織化學(xué)及western blot法檢測TNF-α、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、ICAM-1以及p38的表達均顯著升高，而AQP-1則表達明顯降低、RT-PCR法檢測mRNA轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達結(jié)果基本一致。抗生素及中藥處理組與模型組比較，上述細胞因子除AQP-1外的表達明顯降低，而AQPI表達上調(diào)，低于假手術(shù)組，抗生素及中藥處理組兩組檢測數(shù)據(jù)相近

13、。上述結(jié)果提示中藥組可能通過抑制某種核心細胞因子的表達，繼而抑制其他細胞因子的過度表達來減輕膿毒癥肺損傷。 3.實驗三：與SHAM組比較，模型組應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法、RT-PCR法及western blot法檢測TNF-α、L-1、IL-6、ICAM-1的水平表達明顯升高。而中藥處理組及p38抑制劑組與模型組比較，上述細胞因子的表達則明顯降低，此兩組檢測數(shù)據(jù)相近。 結(jié)論:膿毒癥在創(chuàng)傷和感染等應(yīng)激狀態(tài)下，腸道的屏障功能受損

14、，腸道內(nèi)大量的細菌和內(nèi)毒素經(jīng)門靜脈及淋巴系統(tǒng)侵入血液循環(huán)，造成腸源性感染和毒性網(wǎng)絡(luò)，引起全身多器官功能衰竭，急性肺損傷（ALI）發(fā)生早、病情嚴重，常是病人死亡的直接原因。ALI是以通透性肺水腫為特征的一種臨床綜合征，其嚴重階段即是急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）； ARDS是多種原因引起的肺部失控性炎癥反應(yīng)的結(jié)果，革蘭氏陰性桿菌內(nèi)毒素（LPS）介導(dǎo)炎癥細胞釋放大量細胞因子和炎性介質(zhì)在ARDS的發(fā)病過程中起關(guān)鍵性作用。TNF-α是機體受到有

15、害刺激后最初分泌的細胞因子，它可誘導(dǎo)其它多種因子的產(chǎn)生，這些促炎癥細胞因子之間相互作用可形成許多正反饋環(huán)，導(dǎo)致所謂炎癥“級聯(lián)效應(yīng)”的發(fā)生，但其內(nèi)在相互關(guān)系及調(diào)控可能與某種核心細胞因子有關(guān)，它可聯(lián)系上下游的靶基因。 1.實驗一證實膿毒癥大鼠肺損傷時幾種主要的炎性細胞因子過度表達的情況，并從病理學(xué)角度充分證實。證實了炎性介質(zhì)的過度表達是造成膿毒癥肺損傷的重要原因。經(jīng)復(fù)方清下湯處理的動物模型肺損傷得以減輕。 2.膿毒癥誘發(fā)AL

16、I的內(nèi)在機制相當(dāng)復(fù)雜，本實驗通過膿毒癥大鼠肺損傷模型的建立，應(yīng)用免疫組織化學(xué)、RT-PCR以及western blot等手段，通過測定各組細胞因子灰度值，證實了膿毒血癥大鼠肺損傷時幾種主要的炎性細胞因子過度表達和某些蛋白表達的情況，并從分子生物學(xué)水平證實炎性介質(zhì)TNF-α、IL-1、IL-6、ICAM-1的過度表達和p38通路的活化是造成膿毒癥肺損傷的重要原因，而AQP-1的分泌表達則具有相反效果。經(jīng)復(fù)方清下湯處理的動物模型肺損傷得以減

17、輕，提示我們是否可以通過抑制某種介導(dǎo)多細胞因子過度表達的某種信號通路，為治療膿毒血癥大鼠肺損傷提供一個可能的新的手段。 3.在實驗一、二基礎(chǔ)上，實驗三通過膿毒癥大鼠肺損傷模型的建立，應(yīng)用免疫組織化學(xué)、RT-PCR以及western blot等手段，通過測定各組細胞因子灰度值，證實復(fù)方清下湯和p38抑制劑處理的動物模型肺損傷得以減輕，炎性介質(zhì)TNF-α、IL-1、IL-6、ICAM-1的表達下調(diào)。提示膿毒癥大鼠肺損傷時處于上下游中