緩釋載藥聚乳酸凝膠預(yù)防氣管纖維組織增生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景
　　 喉氣管狹窄(laryngotrachealstenosis，LTS)最常見(jiàn)的病因是機(jī)械性外傷和醫(yī)源性損傷，機(jī)械性外傷包括喉氣管外傷后的軟骨骨折或者氣道挫裂和移位變形，醫(yī)源性損傷包括氣管插管、氣管切開(kāi)、喉部放療及喉部手術(shù)等因素。喉氣管狹窄以聲門(mén)下狹窄（SGS，subglotticstenosis）和氣管狹窄（TS，trachealstenosis）最常見(jiàn)，目前治療方法包括手術(shù)治療、激光治療、支架擴(kuò)張及藥物治療等。常

2、用的手術(shù)方法包括氣管重建術(shù)、環(huán)狀軟骨切除術(shù)、激光手術(shù)包括CO2激光、Nd:YAG激光等方法。對(duì)于預(yù)防喉氣管狹窄手術(shù)后再狹窄及喉氣管惡性腫瘤阻塞需要支架的支撐，但是目前可行的支架都不能順應(yīng)氣道的解剖結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致氣道的損傷，對(duì)喉氣管粘膜刺激引發(fā)的咳嗽，支架移位、脫落，支架上下端部位肉芽的生長(zhǎng)及有可能拔管后再次發(fā)生喉氣管狹窄等一些常見(jiàn)并發(fā)癥尚未得到滿(mǎn)意的解決。對(duì)于良性的喉氣管狹窄，半年至1年后拔出支撐管后還有因纖維組織增生而再次狹窄的可能，肉芽

3、組織的形成是喉狹窄支架置入最常見(jiàn)的并發(fā)癥。近年來(lái)絲裂霉素C(mitomycinC，MMC)抗腫瘤、抗瘢痕形成、減少肉芽組織增生和防止組織粘連的作用得到了公認(rèn)，被廣泛應(yīng)用于臨床相關(guān)治療中。
　　 MMC最早發(fā)現(xiàn)于1956年，是從頭狀鏈霉菌培養(yǎng)液中分離提取的一種廣譜抗腫瘤抗生素。作為一種廣譜抗腫瘤藥物，MMC被用作系統(tǒng)化療藥，應(yīng)用于乳腺、肺、胰腺及結(jié)腸直腸癌的治療中。MMC具有抗腫瘤和抑制增殖的雙重作用，作為一種烷化劑，其主要作用機(jī)

4、制是與DNA的雙螺旋形成交聯(lián)，破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，抑制增殖期DNA的復(fù)制，對(duì)增殖期中的細(xì)胞均有殺傷作用，同時(shí)也作用于靜止期的細(xì)胞，因而可用來(lái)阻止手術(shù)區(qū)的血管再生和瘢痕形成。研究表明，MMC在體內(nèi)和體外均能抑制成纖維細(xì)胞增生，從而減少各種細(xì)胞外基質(zhì)成分合成。MMC可使體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中cyclinD1的表達(dá)下調(diào)，caspase-3的表達(dá)上調(diào)。cyclinD1是細(xì)胞周期中G1期的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，其下調(diào)將阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而抑

5、制細(xì)胞增殖。caspase-3被稱(chēng)為死亡蛋白酶，其上調(diào)將激活凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡過(guò)程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。MMC可能通過(guò)上述途徑抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使成纖維細(xì)胞減少，預(yù)防瘢痕產(chǎn)生。在預(yù)防聲帶術(shù)后的粘連及氣管手術(shù)后的狹窄中，絲裂霉素可能也通過(guò)這些途徑發(fā)揮作用。
　　 局部應(yīng)用絲裂霉素聯(lián)合氣道置入支架治療是一種有前景的方法。在耳鼻咽喉頭頸外科中，絲裂霉素C對(duì)預(yù)防喉粘連和鼻腔粘連有一定療效，但所有研究均是一次性用藥，

6、把含有絲裂霉素C的棉片在創(chuàng)面敷貼4-5分鐘，不能完全解決粘連問(wèn)題。國(guó)外報(bào)道用聚乳酸聚乙醇酸(PolyL-lactide-co-glycolide，PLGA)納米微?？梢宰鳛閯?dòng)物喉部的緩慢釋藥載體，該實(shí)驗(yàn)中將載有德克薩斯紅葡聚糖、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子及牛血清白蛋白的PLGA納米微粒注射到小鼠聲帶，體外實(shí)驗(yàn)中載有這三種不同物質(zhì)的PLGA均可釋放12d-14d天以上，紅葡聚糖在體內(nèi)持續(xù)釋放達(dá)1周，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子在體外仍可以減少TGF-β誘導(dǎo)3T3型

7、成纖維細(xì)胞中膠原的生長(zhǎng)，說(shuō)明了PLGA載藥納米微?？梢蚤L(zhǎng)期釋放藥物并且可以保持藥物的生物活性。
　　 聚乳酸凝膠為可注射用生物降解性材料，其生物組織相容性好。聚乳酸凝膠在冷藏條件下為液態(tài)，常溫下為膠體狀，可攜帶藥物，在喉氣管疾病應(yīng)用方面，可作為良好的注射用藥物緩釋載體。溫敏型聚乳酸凝膠注射到體內(nèi)后，在體溫作用下原位凝固，可將其作為藥物釋放載體，把所需劑量的藥物與聚乳酸凝膠混合后注射到患病部位，可迅速形成凝膠。這種原位形成的水凝膠

8、可以和周?chē)M織牢固的結(jié)合，可控制在特定部位形成凝膠，在病灶處精確地釋放包裹的藥物，有效地控制了凝膠中藥物的釋放范圍，減輕全身的不良反應(yīng)。
　　 地塞米松磷酸鈉（Dexamethasonesodiumphosphate，DSP）為糖皮質(zhì)激素類(lèi)用藥，具有明顯抗炎作用，其對(duì)各種原因（物理、化學(xué)、生物、免疫等）引起炎癥都有很強(qiáng)的抗炎作用，減輕炎癥早期的滲出、水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張、白細(xì)胞浸潤(rùn)及吞噬反應(yīng)。在炎癥后期可抑制毛細(xì)血管和纖維母細(xì)胞的

9、增生，延緩肉芽組織生成，防止粘連及瘢痕形成。其價(jià)格便宜，局部用藥不良反應(yīng)少，可抑制纖維組織增生，本實(shí)驗(yàn)將聚乳酸凝膠作為MMC、DSP的緩釋載體并用于喉氣管外壁纖維組織增生的動(dòng)物模型，研究其對(duì)氣管纖維組織增生的抑制作用，為未來(lái)研究PLGA支架涂層藥物緩釋載體對(duì)喉氣管狹窄的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 目的
　　 探討載MMC與DSP的聚乳酸凝膠在體內(nèi)外的緩釋情況及對(duì)氣管纖維組織增生的抑制作用。
　　 方法
　　

10、 在體外緩釋實(shí)驗(yàn)中，將聚乳酸凝膠加入雙蒸水，于4℃冰箱中放置24h以上，直至完全溶解得到澄明溶液，攪拌下加入MMC、DSP攪拌10min。37℃水浴放置5min，制成原位凝膠。取1mg/ml的MMC聚乳酸凝膠1ml及2mg/ml的DSP聚乳酸凝膠1ml分別置于10mlPH為7.4PBS中，在37℃恒溫?fù)u床中，以120r/min的速度持續(xù)搖蕩。分別于1、4、6、8、12h，1、3、5、7、14、21、28、35d取出樣本200μl并加入等

11、量的新鮮PBS溶液。各樣本通過(guò)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，測(cè)定釋放介質(zhì)中MMC及DSP的含量，藥物的累積濃度通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定。通過(guò)觀察各時(shí)間點(diǎn)留取的浸出液分別測(cè)出在365nm及242nm處的紫外分光光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 在體內(nèi)緩釋試驗(yàn)中，通過(guò)喉氣管外壁損傷建立纖維組織增生的動(dòng)物模型。將42只新西蘭大白兔按照完全隨機(jī)的方法分成7組后進(jìn)行氣管外壁刮傷，將0.2ml載有不同的藥物劑量的聚乳酸凝膠與明膠海綿混勻后置于損傷后的

12、氣管外壁，并用半圓形的硅膠管固定。實(shí)驗(yàn)組包括載MMC組3組(0.1mg，0.2mg，0.4mg)、載藥DSP組3組(1mg，2mg，3mg)和空白對(duì)照組1組。分別于術(shù)后1、3、7、10、14、21d從0.4mgMMC組耳緣靜脈抽血1ml，用質(zhì)譜方法測(cè)量動(dòng)物體內(nèi)藥物釋放濃度。術(shù)后1、7、14d從耳緣靜脈抽血1.5ml測(cè)定血常規(guī)觀察白細(xì)胞計(jì)數(shù)。術(shù)后4周通過(guò)空氣栓塞處死動(dòng)物后取氣管外壁標(biāo)本，標(biāo)本經(jīng)過(guò)福爾馬林固定，石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡

13、下觀察纖維組織增生厚度。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，組間比較采用LSD(Least-significantDifference)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 藥物體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1mgMMC緩釋時(shí)間可達(dá)35天以上，2mgDSP緩釋時(shí)間可達(dá)28天以上，DSP早期釋放相對(duì)較快，6hDSP累積釋放濃度達(dá)(31.5

14、1±2.31)％，28d時(shí)累積釋放濃度達(dá)(92.01±1.76)％，以后釋放逐漸緩慢，逐漸趨于平衡。MMC在21d之前釋放較緩慢，累積釋放濃度達(dá)(32.05±1.81)％，35d時(shí)累積釋放濃度達(dá)(84.28±3.06)％。
　　 在動(dòng)物體內(nèi)兩種藥物凝膠在術(shù)后4周尚未完全降解，各組氣管外壁纖維組織增生厚度如下:空白組:0.82±0.29mm;0.1mgMMC組:0.65±0.16mm;0.2mgMMC組:0.49±0.24mm;0

15、.4mgMMC組:0.17±0.09mm;1mgDSP組:0.31±0.33mm;2mgDSP組:0.18±0.13mm;3mgDSP組:0.14±0.13mm。通過(guò)One-WayANOVALSD檢驗(yàn)，兩種藥物各劑量組（除0.1mgMMC組外）與對(duì)照組比較，纖維組織增生厚度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.482，P=0.000)，說(shuō)明藥物（除0.1mgMMC組外）對(duì)氣管壁纖維組織增生有明顯抑制作用;在MMC凝膠不同劑量組中，0.4mgMMC

16、組與其他劑量組纖維組織增生厚度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.973,P=0.001)，0.4mgMMC纖維組織增生的平均厚度最小，說(shuō)明0.4mgMMC為動(dòng)物體內(nèi)抑制纖維組織增生效果最好的最低劑量;在DSP不同劑量組中，總體差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.988，P=0.395），1mgDSP為動(dòng)物體內(nèi)最大程度抑制氣管瘢痕形成的合適劑量;0.4mgMMC與DSP各組間抑制纖維組織增生的程度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.893,P=0.462)

17、。其中0.4mgMMC組，從第1～21天動(dòng)物體內(nèi)MMC血漿中平均濃度為(0.16±0.12)ng/ml，在第7天釋放濃度達(dá)到高峰，第10天以后藥物釋放逐漸趨于平衡。術(shù)后1、7、14d抽血觀察白細(xì)胞計(jì)數(shù)，白細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(9.03±1.57)×109/L、(9.85±1.63)×109/L、(10.17±3.11)×109/L，通過(guò)One-WayANOVALSD檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3組白細(xì)胞計(jì)數(shù)差別無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明載有MMC的

18、聚乳酸凝膠對(duì)動(dòng)物的骨髓無(wú)明顯抑制作用。
　　 結(jié)論
　　 MMC及DSP聚乳酸凝膠在動(dòng)物體內(nèi)及體外釋放時(shí)間均可長(zhǎng)達(dá)4周以上。在新西蘭大白兔體內(nèi)MMC抑制纖維增生的最合適劑量為0.4mg,DSP最合適劑量為1mg，MMC、DSP聚乳酸凝膠均可作為預(yù)防纖維組織增生的臨床用藥。本研究結(jié)果為未來(lái)研究生物可降解聚乳酸聚乙醇酸(PolyL-lactide-co-glycolide，PLGA)涂層藥物緩釋載體支架對(duì)喉氣管狹窄的治療提供