NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)在模擬失重大鼠動脈重建中的作用.pdf

1、航天飛行時，暴露于微重力環(huán)境可導(dǎo)致航天員心血管系統(tǒng)發(fā)生功能與結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性變化，當(dāng)返回地面1G重力環(huán)境或受到其他立位應(yīng)激時，普遍出現(xiàn)明顯的心血管失調(diào)反應(yīng)，主要表現(xiàn)為立位耐力不良和運動能力降低。近半個世紀(jì)以來，人們對航天后心血管失調(diào)的發(fā)生機理已取得一定認(rèn)識，雖然尚需更多深入的研究工作予以全面闡明，但已有研究結(jié)果證實，動脈功能調(diào)整與結(jié)構(gòu)重塑可能是航天飛行后立位耐力不良發(fā)生的主要機制之一。
　　微重力環(huán)境下，由于流體靜壓消失，全身動脈血管

2、系統(tǒng)跨壁壓及血液分布發(fā)生變化，與地面1G重力下直立體位時相比，人腦部動脈處于相對升高的“高血壓”狀態(tài)，而下身動脈則處于相對降低的“低血壓”狀態(tài)。近年來，地面模擬失重大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，動脈系統(tǒng)功能和結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)區(qū)域特異性改變：大鼠前身動脈血管發(fā)生肥厚性改變，血管收縮反應(yīng)性增強；后身動脈發(fā)生萎縮性改變，血管收縮反應(yīng)性減弱。另外，內(nèi)皮依賴性舒張功能在模擬失重大鼠腹主動脈、頸總動脈和基底動脈均明顯降低，提示模擬失重大鼠動脈內(nèi)皮功能可能發(fā)生變化。在闡

3、明流體靜壓改變引起動脈功能調(diào)整與結(jié)構(gòu)重塑的機理時，我們和其他實驗室均發(fā)現(xiàn)模擬失重大鼠局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)（local rennin-angiotension system，L-RAS）在動脈系統(tǒng)亦呈現(xiàn)區(qū)域特異性改變：RAS主要成份，血管緊張素原和血管緊張素Ⅱ1型受體的基因和蛋白，在前身表達(dá)上調(diào)，而在后身表達(dá)下調(diào)。另外，L-RAS可能通過氧化應(yīng)激損傷機制參與模擬失重大鼠動脈功能的適應(yīng)性變化。除此之外，血管平滑肌離子通道機制可能亦參與模

4、擬失重引起的血管適應(yīng)性變化，并可能發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。然而，L-RAS和血管平滑肌離子通道機制只能部分解釋模擬失重所致的動脈內(nèi)皮功能異常的發(fā)生。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，模擬失重引起大鼠動脈血管產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，無論在彈力型大動脈（腹主動脈和頸總動脈）還是在肌型小動脈（腦動脈），活性氧（reactive oxygen species，ROS）主要成份超氧陰離子（superoxide anion，O2-·）水平均明顯升高。核因子-κB（nuclea

5、r factorκB，NF-κB）被認(rèn)為是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與心血管系統(tǒng)的炎性反應(yīng)、細(xì)胞增生、分化和凋亡等過程。在心血管功能和結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)機制中，NF-κB是L-RAS和ROS下游的共同通路，參與多種心血管疾病血管功能損傷的病理生理過程。在失重/模擬失重狀態(tài)下，NF-κB是否參與彈力型大動脈及肌型小動脈功能的損傷過程目前尚未有報道。另外，本實驗室前期工作中僅在動脈血管炎性反應(yīng)方面作了初步研究，對模擬失重后動脈炎性反應(yīng)情況尚缺乏全面的了

6、解。NF-κB是否通過炎性反應(yīng)機制參與模擬失重大鼠前身和后身彈力型大動脈及肌型小動脈血管內(nèi)皮功能的重塑過程也有待進(jìn)一步探討。
　　為了回答上述問題，我們采用尾部懸吊大鼠模型模擬微重力對心血管系統(tǒng)的影響，并進(jìn)行以下工作：
　　1.模擬失重大鼠腹主動脈、頸總動脈和腦動脈血管NF-κB蛋白表達(dá)與活性改變
　　采用Western blot方法觀察模擬失重3天、14天和28天后大鼠腹主動脈、頸總動脈和腦動脈NF-κB亞單位p65

7、蛋白在胞核與胞漿的分布變化以及IκBα蛋白的表達(dá)變化，檢測模擬失重對NF-κB由胞漿向胞核轉(zhuǎn)位的影響并確定何時影響最為明顯。另外，使用NF-κB抑制劑吡咯二硫氨基甲酸酯（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC,100 mg/kg/day）慢性灌胃干預(yù)處理，觀察模擬失重后NF-κB DNA結(jié)合能力的變化，并觀察PDTC對模擬失重大鼠動脈NF-κB DNA結(jié)合能力的抑制作用。
　　2.模擬失重大鼠腹主動脈、頸

8、總動脈和腦動脈血管炎性反應(yīng)及NF-κB的調(diào)控作用
　　通過en face免疫熒光染色和離體血管內(nèi)皮單核細(xì)胞粘附能力檢測，觀察模擬失重大鼠腹主動脈和頸總動脈的單核細(xì)胞浸潤情況以及動脈內(nèi)皮的單核細(xì)胞粘附能力；通過Western blot和免疫組織化學(xué)染色方法檢測模擬失重大鼠腹主動脈、頸總動脈和腦動脈炎性反應(yīng)相關(guān)因子血管細(xì)胞粘附分子1（vascular cell adhesion molecule1，VCAM-1）、E-選擇素（E-se

9、lectin）和單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein1，MCP-1）的表達(dá)變化；通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測模擬失重大鼠血漿中白介素6（interleukin6，IL-6）含量的變化。另外，采用PDTC慢性干預(yù)處理，通過實時定量 PCR方法檢測 NF-κB激活對模擬失重大鼠腹主動脈、頸總動脈和腦動脈VCAM-1、E-selectin和MCP-1 mRNA水平的影響。
　　3. NF-κB通

10、路抑制劑PDTC對模擬失重大鼠腹主動脈、頸總動脈和大腦中動脈舒張反應(yīng)性的影響
　　采用PDTC慢性干預(yù)處理，通過動脈反應(yīng)性測定，觀察PDTC對模擬失重大鼠腹主動脈、頸總動脈和大腦中動脈血管舒張反應(yīng)性變化的影響。
　　本工作的主要結(jié)果如下：
　　1.模擬失重增強了大鼠腹主動脈、頸總動脈和腦動脈血管NF-κB的活性
　　Western blot結(jié)果表明：與對照組相比，模擬失重大鼠腹主動脈、頸總動脈和腦動脈NF-κB亞

11、單位p65蛋白在胞核中表達(dá)隨懸吊時間的延長而逐漸增加，胞漿p65和IκBα蛋白的表達(dá)則隨著懸吊時間的延長而逐漸降低，其中腹主動脈變化早于頸總動脈和腦動脈。凝膠電泳遷移率分析結(jié)果顯示：28天模擬失重大鼠腹主動脈、頸總動脈和腦動脈NF-κB的DNA結(jié)合能力與對照組相比均明顯增強；PDTC慢性干預(yù)處理明顯降低了腹主動脈、頸總動脈和腦動脈增強的NF-κB DNA結(jié)合能力，但在腦動脈僅有部分恢復(fù)。
　　2.模擬失重增強了大鼠腹主動脈和頸總動

12、脈的單核細(xì)胞浸潤及與THP-1細(xì)胞的粘附，NF-κB參與模擬失重引起的大鼠腹主動脈、頸總動脈及腦動脈血管炎性反應(yīng)的發(fā)生
　　En face免疫熒光染色結(jié)果顯示，模擬失重大鼠腹主動脈和頸總動脈單核細(xì)胞浸潤增加。離體血管內(nèi)皮單核細(xì)胞粘附能力測定結(jié)果顯示，模擬失重大鼠腹主動脈和頸總動脈內(nèi)皮表面粘附的THP-1細(xì)胞明顯增多。Western blot和免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果顯示：模擬失重大鼠腹主動脈、頸總動脈和腦動脈血管E-selectin和

13、MCP-1蛋白表達(dá)上調(diào)；VCAM-1在模擬失重大鼠頸總動脈和腦動脈表達(dá)上調(diào)，但在腹主動脈表達(dá)沒有改變；模擬失重大鼠各動脈增加的炎性因子陽性表達(dá)主要集中于內(nèi)皮層和平滑肌內(nèi)層。酶聯(lián)免疫吸附結(jié)果顯示，模擬失重大鼠血漿中IL-6水平與對照組大鼠相比明顯升高。實時定量PCR結(jié)果顯示：模擬失重大鼠腹主動脈、頸總動脈和腦動脈VCAM-1、E-selectin和MCP-1的mRNA水平與對照組相比均明顯增高；PDTC慢性干預(yù)處理明顯降低模擬失重大鼠腹主

14、動脈和頸總動脈炎性因子的mRNA水平，在腦動脈僅降低了MCP-1的水平。
　　3. NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)參與模擬失重所致大鼠腹主動脈、頸總動脈和大腦中動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的降低
　　離體動脈血管環(huán)實驗表明：模擬失重大鼠腹主動脈、頸總動脈和大腦中動脈ACh介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)性與對照組大鼠相比明顯降低；PDTC慢性干預(yù)處理可明顯改善模擬失重大鼠腹主動脈和頸總動脈降低的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)性，但在大腦中動脈僅有恢復(fù)趨勢。