2014-2015年上海地區(qū)犬細(xì)小病毒分離鑒定及基因分型.pdf

1、犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的一種急性、接觸性傳染病，屬于犬的主要烈性傳染病之一，具有傳染性強(qiáng)、發(fā)病率和死亡率高等特點(diǎn)。犬細(xì)小病毒從1978年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，由于其變異速率快，宿主范圍不斷擴(kuò)大，給其防治增加了困難，嚴(yán)重影響了我國(guó)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。
　　首先，本論文根據(jù)CPV的VP2基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性PCR引物，對(duì)采自上海及周邊地區(qū)的30株CPV進(jìn)行分子鑒定和基因分型，檢測(cè)

2、結(jié)果表明：New CPV-2a20株（20/30）占67％，New CPV-2b7株（7/30）占23%，CPV-2c3株（3/30）占10%。由此可以看出，目前上海地區(qū)CPV主要以New CPV-2a和New CPV-2b基因型為主，同時(shí)也出現(xiàn)了CPV-2c基因型。對(duì)其VP2基因序列分析發(fā)現(xiàn)6個(gè)核苷酸突變導(dǎo)致氨基酸發(fā)生變化，3株CPV-2c在相同位點(diǎn)發(fā)生突變，7株New CPV-2b也在相同的位點(diǎn)發(fā)生了突變。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)看出我國(guó)犬細(xì)小分

3、離株與國(guó)外分離株屬于不同分支。
　　其次，為了進(jìn)一步探究上海地區(qū)三種基因型CPV的遺傳變異和分子致病機(jī)理，本論文分別選取三種基因型的分離株：SH14株（New CPV-2a）、SH1515株（New CPV-2b）和SH1516株（CPV-2c）為研究對(duì)象，將這三株CPV的小腸組織研磨，運(yùn)用同步接種方法接種 CRFK細(xì)胞，分離病毒；然后，分別利用PCR和病毒學(xué)方法對(duì)病毒進(jìn)行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種基因型CPV均可在CRFK細(xì)胞上良好生

4、長(zhǎng)，并產(chǎn)生細(xì)胞變圓、脫落等特征性細(xì)胞病變；PCR方法均能檢測(cè)到CPV基因組；間接免疫熒光試驗(yàn)和蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)均證明病毒VP2蛋白在CRFK細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)；在電鏡下可以觀察到直徑在20nm左右，具有細(xì)小病毒形態(tài)特征的病毒顆粒；將分離的病毒接種試驗(yàn)動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)在攻毒后3天，可以從試驗(yàn)犬糞便中檢測(cè)到CPV，并持續(xù)排毒一周。所分離三種基因型CPV在CRFK細(xì)胞中的病毒滴度（TCID50）分別為10-4.9/0.1mL（SH14株）、10-4.8

5、/0.1mL（SH1515株）、10-4.6/0.1mL（SH1516株）。為進(jìn)一步了解三種基因型CPV在細(xì)胞中的增殖特性，本研究分別測(cè)定了它們?cè)贑RFK細(xì)胞中的一步生長(zhǎng)曲線，結(jié)果表明三種基因型CPV在CRFK細(xì)胞上增殖規(guī)律相似：即病毒在感染細(xì)胞后0-12h為潛伏期，12h后病毒粒子開(kāi)始增殖，36h到60h為病毒快速增殖期，病毒滴度在感染后60h后達(dá)到最高，72h后隨著細(xì)胞的裂解和死亡，病毒滴度開(kāi)始下降。
　　最后，根據(jù)三種基因型

6、CPV參考株序列，我們?cè)O(shè)計(jì)5對(duì)特異性PCR引物，從分離的三種基因型CPV中成功擴(kuò)增出它們的全基因組序列。其中SH14株（New CPV-2a）全長(zhǎng)5062bp，SH1515株（New CPV-2b)全長(zhǎng)5014bp，SH1516株(CPV-2c)全長(zhǎng)5002bp。利用DNASTAR軟件對(duì)基因序列進(jìn)行了比對(duì)分析，結(jié)果顯示三種基因型CPV基因組均含有兩個(gè)編碼框架：ORF1和ORF2，分別編碼NS1、NS2、VP1、VP2四種蛋白。其中ORF

7、1編碼的NS1長(zhǎng)2007bp，中間包含498bp的NS2基因，分別編碼669和166個(gè)氨基酸。ORF2編碼VP1長(zhǎng)2184bp，其中包含1755bp VP2基因，分別編碼728和585個(gè)氨基酸。三株病毒3’端和5’端序列存在差異，和其它細(xì)小病毒一樣，三株病毒兩端存在兩個(gè)非編碼區(qū)，并存在典型的“Y”型發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
　　對(duì)三種基因型CPV同源性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示SH14株（New CPV-2a）與CPV/CN/SD10/2014株核苷酸

8、同源性最高，達(dá)98.8%；SH1515株（New CPV-2b）與CPV/CN/JL6/2013株和CPV/CN/HB1/2013核苷酸同源性最高，達(dá)99.9%；SH1516株(CPV-2c)與CPV-LZ2(2b)株核苷酸同源性最高，達(dá)99.2%；從系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)可以看出：CPV在不斷的進(jìn)化過(guò)程中逐漸形成了不同的分支，其中，我國(guó)犬細(xì)小不同分離株之間親緣性相對(duì)較近，位于同一大的分支，而與國(guó)外分離株的親緣性相對(duì)較遠(yuǎn)。
　　綜上所述，本論