人生長分化因子5的克隆、表達和誘導活性的初步研究.pdf

1、生長分化因子5(Growth differentiation factor 5,GDF5)是TGF-β超家族(Transforming growth factor-β supeffamily TGF-β)骨形態(tài)發(fā)生蛋白亞家族(bone morphogenetic proteins subfamily BMPs)較特殊的一員,優(yōu)勢表達于關節(jié)軟骨組織,它在軟骨發(fā)生和長骨發(fā)育中具有重要作用,可促進體外培養(yǎng)間質(zhì)祖細胞的軟骨和骨生成活性,體內(nèi)移植

2、研究表明GDF5能異位誘導生成軟骨和骨組織,而且主要誘導軟骨樣組織.為了進一步了解GDF5的生物學活性以及拓展其在骨和軟骨組織工程中的應用,特進行了該實驗.該研究從人胎兒軟骨組織中提取總RNA,利用RT-PCR的方法分別克隆了GDF5完整成熟肽和全長cDNA序列,并分別把兩個序列克隆入原核表達載體pET22b(+)和真核表達載體pEGFP-C2,構建了重組原核表達載體pET22b(+)-GDF5和重組真核表達載體pEGFP-C2-GDF

3、5.原核重組子轉化大腸桿菌BL-21(DE3)后用IPTG進行成熟肽的誘導表達,SDS-PAGE電泳檢測表達蛋白的誘導動力學,Western bloting鑒定表達蛋白.凝膠介質(zhì)鎳離子螯合法純化目的蛋白,植入小鼠后肢股部肌袋內(nèi)進行表達蛋白的生物學活性鑒定.同時分離培養(yǎng)人胎兒骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs),流式細胞儀鑒定MSCs表面抗原.LipofectAMINE脂質(zhì)體法轉染重組子pEGFP-C