黑色素瘤激活因子CXCL1與不同亞型IL-8在惡性卵巢腫瘤組織中的表達研究.pdf

1、第一章卵巢惡性腫瘤蛋白組學研究現(xiàn)況(文獻綜述)卵巢惡性腫瘤是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，由于臨床癥狀隱匿，缺乏有效的早期診斷方法，超過70％的患者就診時已為晚期，死亡率居婦科惡性腫瘤之首。腫瘤標志物CA125特異性不強，存在假陽性，不能單獨用于卵巢癌篩查。而高通量的蛋白組學技術和生物信息學工具將為卵巢癌生物標志物的大規(guī)模快速篩查提供有力武器。 黑色素瘤激活因子CXCL1(GRO-a)和IL-8(CXCL8)同屬于趨化因子，多項

2、研究表明，黑色素瘤激活因子CXCL1和IL-8對卵巢惡性腫瘤的發(fā)生、信號轉導過程等有著重要的影響。本實驗室先期發(fā)現(xiàn)CXCL1和不同亞型的IL-8蛋白(1-77aa)、(6-77aa)和(9-77aa)可能在卵巢癌的早期診斷中起重要作用。本課題為探討綜合判斷CXCL1蛋白和不同亞型IL-8的表達能否成為卵巢癌早期診斷的新標志而努力，旨在推動卵巢癌的診斷由應用單一腫瘤標志物發(fā)展成為應用蛋白質譜的改變來進行綜合判斷。 第二章CXCL1

3、和不同亞型IL-8蛋白的原核表達 目的：通過基因工程技術，擴增出編碼CXCL1和不同亞型IL-8成熟肽的基因全長，構建其原核表達載體，表達CXCL1和不同亞型IL-8蛋白。 方法：選取漿液性卵巢癌組織作為模板提取人卵巢癌組織總mRNA，逆轉錄成cDNA，利用PCR技術擴增編碼CXCL1和不同亞型IL-8(1-77aa)、IL-8(6-77aa)和IL-8(9-77aa)的成熟肽基因。將擴增產(chǎn)物與原核表達載體PETSUMO

4、連接，構建原核表達載體并測序鑒定重組子。 結果：成功構建了CXCL1和不同亞型IL-8(1-77aa)、IL-8(6-77aa)和IL-8(9-77aa)的原核表達載體，重組子經(jīng)測序驗證同源性均達100％。將其轉化至表達菌株表達融合蛋白，后者經(jīng)鎳柱純化后，通過SUMO蛋白酶酶解去除SUMO載體蛋白，MALDI-TOF-MS的結果證明獲得了CXCL1、IL-8(1-77aa)、IL-8(6-77aa)和IL8(9-77aa)的成熟

5、蛋白。 結論：通過成功表達小分子量的CXCL1和不同亞型IL-8的成熟肽，為課題的深入研究打下了堅實的試驗基礎。原核表達的產(chǎn)物可用作質譜檢測的標準品或作為高純度的抗原用于制備相應的單克隆抗體等。 第三章激光顯微捕獲聯(lián)合免疫磁珠的技術在質譜檢測中的應用及CXCL1和不同亞型IL-8蛋白在惡性卵巢腫瘤組織中的表達研究 目的：建立一種質譜專一性檢測卵巢組織上皮細胞中CXCL1及不同亞型IL-8(1-77aa)、IL-8

6、(6-77aa)和IL-8(9-77aa)表達的技術方法，以進一步探討CXCL1及不同亞型IL-8在惡性卵巢腫瘤組織中的表達及其與卵巢惡性腫瘤早期診斷之間的關系。 方法：利用激光顯微捕獲分別收集卵巢惡性腫瘤、良性腫瘤、正常卵巢組織中的卵巢上皮細胞，裂解細胞蛋白后，通過包被有CXCL1或IL-8抗體的免疫磁珠特異結合上述細胞蛋白裂解液中的CXCL1或各亞型的IL-8蛋白，經(jīng)微量層析柱濃縮免疫磁珠洗脫液后，采用MALDI-TOF-M

7、S檢測免疫磁珠洗脫液中的CXCL1或各亞型的IL-8。 結果：①經(jīng)激光顯微捕獲能精確收集到卵巢惡性腫瘤及其良性或正常對照組織中的卵巢上皮細胞，收集到的細胞數(shù)量級達105-106。MALDI-TOF-MS檢測結果顯示免疫磁珠與上述組織細胞裂解液中的CXCL1及不同亞型IL-8結合情況良好，且各亞型的IL-8經(jīng)質譜可得到較好的區(qū)分。②CXCL1在卵巢惡性組織細胞中高表達(陽性率為90％)，在良性及正常對照中不表達。③IL-8(1-7

8、7aa)在卵巢惡性、良性、正常組織細胞中均有表達(陽性率分別為40％，100％和66.67％)；IL-8(6-77aa)在卵巢惡性組織細胞中表達(陽性率為30％)，在良性及正常對照中不表達；IL-8(9-77aa)在所有組織細胞樣本中均未見表達。 結論：①成功建立了利用質譜專一性研究卵巢組織上皮細胞中CXCL1及不同亞型IL-8(1-77aa)、IL-8(6-77aa)和IL-8(9-77aa)表達的技術方法。②CXCL1由惡性