頭孢地嗪免疫調(diào)節(jié)作用LPS-TLR-,4--NF-kappaB途徑的研究.pdf

1、背景： 自抗菌藥物應(yīng)用以來(lái)，人們普遍認(rèn)為感染性疾病的預(yù)后主要取決于抗菌藥物與病原菌的相互作用，忽視了人體免疫機(jī)制在殺滅細(xì)菌過(guò)程中的重要作用。然而實(shí)踐證明，有效的抗菌藥物治療，必須有完整的機(jī)體防御機(jī)制參與。機(jī)體的防御功能在感染性疾病的預(yù)后上起著重要的作用?？咕幬锏淖饔貌皇撬幬飳?duì)細(xì)菌的單一作用，而是抗菌藥物，機(jī)體和病原菌之間相互作用的一個(gè)復(fù)雜過(guò)程。 抗菌藥物的免疫調(diào)節(jié)作用已積累了一定的資料，研究最多的是頭孢地嗪(Cefod

2、izime，CDZM)和頭孢咪唑(Cefpimizole)，其中又以頭孢地嗪最為豐富。有研究表明，頭孢地嗪有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，但目前的研究大多數(shù)是對(duì)臨床效應(yīng)的觀察，．對(duì)其機(jī)制的較深入的探索還處于起始階段。 CDZM與其他頭孢菌素一樣具有較廣的抗菌譜。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察發(fā)現(xiàn)，CDZM在體內(nèi)的抗菌活性比較顯著，特別是對(duì)免疫缺陷動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)感染模型的治療中取得了明確效果，提示其在抗菌的同時(shí)對(duì)宿主的防御功能起協(xié)同作用，研究表明它的增強(qiáng)機(jī)

3、體防御功能性質(zhì)與其結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系． 近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，人們對(duì)免疫應(yīng)答及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究逐步上升到分子水平，抗原受體及其他細(xì)胞膜分子介導(dǎo)的信號(hào)傳遞過(guò)程的研究已成當(dāng)代免疫學(xué)研究的主要前沿領(lǐng)域。因此，對(duì)疾病發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)初制的研究已成為現(xiàn)代危重病醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿課題。通過(guò)對(duì)頭孢地嗪信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)的分析探討，明確其合適的劑量與療程，闡明免疫調(diào)節(jié)基團(tuán)的作用機(jī)制，改建與構(gòu)建合理的化學(xué)基團(tuán)，做到抗病毒、抗菌和免疫調(diào)節(jié)的合

4、理統(tǒng)一。 革蘭氏陰性桿菌引起機(jī)體損傷主要由LPS介導(dǎo)，人體集聚革蘭氏陰性桿菌最豐富的場(chǎng)所是腸道，所產(chǎn)生的LPS首先到達(dá)肝臟。于是肝臟成了LPS第一個(gè)攻擊的靶器官。在慢性肝病殘存肝細(xì)胞很少的基礎(chǔ)上再次經(jīng)受LPS的損傷，就可能導(dǎo)致肝衰竭的發(fā)生。一般認(rèn)為，LPS入侵機(jī)體，首先借助LBP(脂多糖結(jié)構(gòu)蛋白)／CDl4結(jié)合細(xì)胞表面，進(jìn)而通過(guò)某種未知的方式作用于TLR4，通過(guò)TLR4將LPS的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)。蛋白激酶C(PKC)作用于IKB

5、，磷酸化的IKB迅速釋放并分解一種小分子蛋白NF-KB，該蛋白為許多細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子，NF．KB活化后，可增強(qiáng)TNFQ和IUB的基因轉(zhuǎn)錄，使TNFQ和ILlβ產(chǎn)生和釋放增多，進(jìn)而TNFa和ILlB再次激活NF-KB；NF-KB活化后還可使IL-6和IL-8產(chǎn)生和釋放增多，導(dǎo)致最初的炎癥信號(hào)進(jìn)一步放大。因此，機(jī)體可以通過(guò)LPS-TLR4-NF-kappaB途徑產(chǎn)生系列的免疫應(yīng)答。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)免疫肝損傷小鼠體內(nèi)給予頭孢地嗪處理，加

6、強(qiáng)其免疫調(diào)節(jié)作用的研究，探索其在體內(nèi)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以探討頭孢地嗪的藥理作用機(jī)制。 材料與方法： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Balb／c小鼠，6-8周齡，雌性，體重19-21g，購(gòu)于鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。本試驗(yàn)采用卡介苗聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)法，首先建立免疫性肝損傷的小鼠模型，然后將大腸埃希菌腹腔注射來(lái)建立免疫性肝損傷合并敗血癥小鼠模型；分設(shè)CDZM500mg／kg組、CDZM200mg／kg組、CDZM50mg／kg組、Thy組、CRO組和N

7、S組，每組21只；將小鼠按上述分組進(jìn)行完全隨機(jī)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，連續(xù)用藥7d后停藥，在第7d、第14d和第2ld分別取7只小鼠收集肝臟和脾臟。 將收集的肝臟進(jìn)行石蠟包埋，根據(jù)免疫組化SP法常規(guī)步驟進(jìn)行染色。觀察TLR4、PKC、NF-rB在肝臟中的表達(dá)變化，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行綜合評(píng)定，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 將收集的脾臟采用RT-PCR技術(shù)，對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中TLR4、NF-KBmRNA進(jìn)行半定量分析，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)

8、計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 1、免疫組化法： (1)在同一時(shí)間，CDZM500mg／kg、CDZM200mg／kg、CDZM50mg／kg、Thy、CRO、NS各組TLR4、PKC、NF-r．B的表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p

9、地嗪劑量的增加，TLR4、PKC、NF-r．B的表達(dá)均有減少趨勢(shì)，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0．05)； (2)在不同時(shí)間，CDZM同一劑量組TLR4、PKC、NF-r．B的表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>O．05)： 2、RT-PCR法： (1)在同一時(shí)間，CDZM500mg／kg、CDZM200mg／kg、CDZM50mg／kg、Thy、CRO、NS各組TLR4、NF-r．B的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0．01)；在同