TAT介導NEP1-40轉(zhuǎn)導對大鼠局腦缺血的保護作用.pdf

1、本文擬利用TAT蛋白轉(zhuǎn)導技術(shù)介導NEP1-40轉(zhuǎn)導入腦組織。將NEP1-40克隆到pTAT-HA載體上，體外表達、純化重組TAT-NEP1-40融合蛋白。然后，將純化后的TAT-NEP1-40通過腹腔注射的方式給藥，來檢測融合蛋白TAT-NEP1-40對短暫性局腦缺血是否具有保護作用，用TAT-β-Gal蛋白作為對照。缺血模型采用大腦中動脈栓塞誘導缺血2h，兩種蛋白均通過腹腔注射給缺血后的大鼠。再灌注24h時TTC法測定腦梗塞容積，TU

2、NEL染色法檢測TAT-NEP1-40對缺血后腦細胞的保護作用。 獲得主要實驗結(jié)果如下： 1)TAT-NEP1-40的克隆、表達和純化利用PCR技術(shù)從KIAA0886中擴增編碼Nogo-66氨基端40個氨基酸殘基：RIYKGVIQAIQKSDEGHPFRAYLESEVAISEELVQKYSNS的序列，克隆到pTAT-HA載體上，測序證實序列無誤。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DE3(BL21)，IPTG誘導表達、Ni離子親和柱純化TAT-N

3、EP1-40融合蛋白，SDS-PAGE分析鑒定融合蛋白的表達。結(jié)果表明TAT-NEP1-40在DE3中以包含體形式高表達；經(jīng)純化可以得到高純度的融合蛋白。親和純化后的融合蛋白TAT-NEP1-40經(jīng)透析法進行復性，復性后的蛋白經(jīng)超濾濃縮后，BCA法測定蛋白濃度為170ug/mL。　　2)TAT-NEP1-40的轉(zhuǎn)導作用將TAT-NEP1-40加到PC12細胞培養(yǎng)液中，孵育60min，免疫熒光染色可以觀察到TAT-NEP1-40進入細胞

4、內(nèi)。將TAT-NEP1-40腹腔注射SD大鼠融合蛋白6h后，灌注固定，冰凍切片，免疫組化染色，結(jié)果顯示TAT融合蛋白可以在腦實質(zhì)中廣泛分布。 3)體外模擬缺血模型，TAT-NEP1-40保護PC12的缺氧損傷用連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)合并缺糖模擬PC12細胞缺血模型，缺氧處理60min后加入融合蛋白TAT-NEP1-40孵育24h，經(jīng)MTT法測定細胞活力和FCM檢測凋亡細胞均顯示融合蛋白對缺氧具有保護作用。 4)T

5、AT-NEP1-40局部缺血后腦保護作用線栓塞法致大腦中動脈阻塞(MCAO)局腦缺血再灌流損傷模型。栓塞2h，再灌注24h。再灌注前腹腔注射融合蛋白。TTC染色，測腦梗死容積。結(jié)果顯示TAT-NEP1-40融合蛋白可以減少腦梗死容積。 大鼠局腦缺血，腹腔注射融合蛋白。灌注固定，冰凍切片后TUNEL染色，與對照蛋白比較結(jié)果顯示，TAT-NEP1-40融合蛋白可以明顯減少凋亡細胞數(shù)量。 本研究結(jié)果將有助于進一步研究NEP1-