RNAi在胰腺癌基因治療中的交叉抑制性效果研究.pdf

1、目的：構建表達短發(fā)卡RNA(shRNA)的質粒載體，觀察其在K-ras基因突變類型為GAT和GTT的人胰腺癌細胞株PANC-1和CFPAC-1間的交叉抑制效果，為RNAi技術應用于治療胰腺癌奠定一定的理論和實驗基礎。 方法： 1、針對GAT和GTT兩種K-ras基因突變類型，分別設計兩條shRNA序列，并分別加載到質粒載體pGenesil-1上，構建針對人胰腺癌細胞株PANC-1和CFPAC-1的K-ras基因的質粒pG

2、enesil-1GAT和pGenesil-1GTT。 2、應用質粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT瞬時轉染K-ras突變類型為GAT的人胰腺癌細胞株PCNA-1，同時將質粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT瞬時轉染具有K-ras突變類型為GTT的人胰腺癌細胞株CFPAC-1。每種細胞分4組，分別為特異性抑制組，交叉性抑制組，空白質粒組和對照組，其中特異性抑制組轉染同細胞K-ras基因突變

3、類型相同的質粒，交叉性抑制組轉染與其K-ras基因突變類型不同的質粒，空白對照組轉染空白質粒pGenesil-1KB，對照組以1×PBS轉染作為對照。用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和免疫印跡法(Western-blot)方法檢測轉染后細胞K-ras基因的表達情況，并采用CCK-8(ceIl counring kit-8)活細胞計數法，繪制轉染前后細胞的生長曲線，以檢測質粒pGenesil-1GAT對胰腺癌細胞PANC-1的K-r

4、as基因的抑制效果和質粒pGenesil-1GTT對PANC-1細胞的交叉抑制效果，以及質粒pGenesil-1GTT對胰腺癌細胞CFPAC-1的K-ras基因的抑制效果和質粒pGenesil-1GTT對CFPAC-1細胞的交叉抑制效果。 結果： 1、通過酶切鑒定和送檢基因測序證實插入shRNA序列正確，成功構建了質粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT。 2、將質粒pGenesil-1GAT和

5、pGenesil-1GTT瞬時轉染到PANC-1細胞后，PANC-1特異性抑制組(轉染pGenesil-1GAT的細胞)細胞的K-ras基因mRNA和蛋白表達水平明顯下降，與交叉抑制組(轉染pGenesil-1GTT的細胞)相比結果有顯著性差異(p<0.05)，與轉染空白質粒組(轉染pGenesil-1KB的細胞)相比結果有顯著性差異(p<0.05)，與對照組相比結果亦有顯著性差異(p<0.05)，細胞生長明顯受限，對數生長期后移，平臺

6、期水平低，細胞生長曲線明顯向右下移動，而PANC-1細胞交叉抑制組(轉染pGenesil-1GTT的細胞)的K-ras基因mRNA和蛋白表達水平下降不明顯，與轉染空白質粒組(轉染pGenesil-1KB的細胞)相比結果無顯著性差異(p>0.05)，與未轉染的空白對照組最相比結果亦無顯著性差異(p>0.05)。細胞生長未見明顯影響。 3、將質粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT瞬時轉染到CFPAC-1細胞后，特

7、異性抑制組(轉染pGenesil-1GTT的細胞)K-ras基因mRNA和蛋白表達水平明顯下降，與交叉抑制組(轉染pGenesil-1GAT的細胞)相比結果有顯著性差異(p<0.05)，與空白質粒組(轉染pGenesil-1KB的細胞)相比結果有顯著性差異(p<0.05)，與對照組相比結果亦有顯著性差異(p<0.05)，細胞生長亦明顯受限。而交叉抑制組(轉染pGenesil-1GAT的細胞)K-ras基因mRNA和蛋白表達水平下降不明顯

8、，與空白質粒組(轉染pGenesil-1KB的細胞)相比結果無顯著性差異(p>0.05)，與對照組相比結果亦無顯著性差異(p>0.05)，細胞生長未受影響。 結論： 1、針對胰腺癌細胞K-ras基因突變位點設計的shRNA能夠有效地加載到pGencsil-1質粒載體上，并且重構的質粒載體都可以高效的轉染人胰腺癌細胞株PANC-1和CFPAC-1。 2、突變特異性的shRNA可以特異性的抑制相應突變類型的K-ras