鉛暴露對(duì)骨骼形成的影響及其機(jī)理研究.pdf

1、鉛是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的重金屬元素，它可廣泛作用于神經(jīng)、造血、消化、泌尿和生殖系統(tǒng)。因此，鉛污染已經(jīng)受到國(guó)際社會(huì)的廣泛關(guān)注。嬰幼兒、兒童和青少年體內(nèi)的鉛負(fù)荷過(guò)重將直接影響其體格和智力發(fā)育。鈣在體內(nèi)的生物利用率與骨骼的發(fā)育有著直接的關(guān)系，那么鉛對(duì)骨骼形成的影響是否與鉛影響鈣的生物利用率有關(guān)呢?鑒于一方面鉛影響機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育，體內(nèi)的鉛75-90％沉積在骨骼，另一方面鈣作為與骨骼發(fā)育密切相關(guān)的的礦物質(zhì)，其在體內(nèi)也主要分布于(大約99％)骨骼

2、內(nèi)，因此，探討鉛與鈣的相互作用及其對(duì)骨骼形成的作用機(jī)理是一個(gè)十分重要而又有趣的課題。 本項(xiàng)目采用人群研究、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)相結(jié)合的方法進(jìn)行。首先通過(guò)整群隨機(jī)抽樣的方法，研究重慶市2～7歲兒童體內(nèi)的鉛暴露情況，進(jìn)而觀察體內(nèi)鉛負(fù)荷過(guò)重兒童體內(nèi)鈣、磷和OC的水平、形體發(fā)育及缺鈣體征(如佝僂病等)的發(fā)生情況；其次設(shè)計(jì)鉛染毒大鼠的不同鈣攝入，觀察大鼠生長(zhǎng)發(fā)育，檢測(cè)骨骼中鉛和鈣的含量，比較大鼠股骨的顯微結(jié)構(gòu)，同時(shí)以<'45>CACl<,

3、2>示蹤研究鉛對(duì)鈣吸收的影響，測(cè)定鉛作用下大鼠OC、PTH及PTHr1表達(dá)的變化，以初步探討鉛對(duì)鈣吸收利用、骨骼形成的影響及其機(jī)理；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)則采用原代OB和骨肉瘤細(xì)胞UMR106進(jìn)一步闡釋鉛對(duì)鈣及骨骼發(fā)育作用的分子學(xué)機(jī)制：鉛對(duì)OB和UMR106細(xì)胞形態(tài)和生物標(biāo)志物、OC及其調(diào)控因子的表達(dá)以及可能參與其中的MAPK(ERK1/2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。 本研究的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1．非工業(yè)區(qū)兒童身高平均為106.11cm，

4、體重為18.63kg；而工業(yè)區(qū)兒童的身高為103.74cm、體重為17.57kg。非工業(yè)區(qū)兒童體內(nèi)血鉛含量(65.29μg/L)明顯低于工業(yè)區(qū)兒童(75.29μg/L)；與之相似的是，工業(yè)區(qū)兒童發(fā)鉛含量也明顯高于非工業(yè)區(qū)兒童，但血鈣含量則剛好與兒童體內(nèi)鉛水平相反。工業(yè)區(qū)兒童血磷水平較非工業(yè)區(qū)高，但正常范圍[Ca]×[P]值(≥3.5)兒童比例明顯低于非工業(yè)區(qū)。工業(yè)區(qū)和非工業(yè)區(qū)間兒童體內(nèi)血清OC含量差異明顯，非工業(yè)區(qū)兒童體內(nèi)OC為11.2

5、2μg/L，而工業(yè)區(qū)兒童21.20μg/L。工業(yè)區(qū)和非工業(yè)區(qū)相同年齡及性別之間兒章OC含量有顯著性差異，但區(qū)內(nèi)兒童年齡及性別之間OC水平相似。統(tǒng)計(jì)分析表明，工業(yè)區(qū)和非工業(yè)區(qū)兒童體內(nèi)鉛暴露差異與兒童生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)，提示鉛可能通過(guò)抑制骨骼鈣沉積和骨鈣素的分泌影響兒童的生長(zhǎng)發(fā)育。 2．鉛染毒40d后，大鼠體重、身長(zhǎng)和尾長(zhǎng)的增長(zhǎng)呈現(xiàn)如下變化：低鈣鉛處理組<鉛處理組<高鈣鉛處理組<對(duì)照組。對(duì)照組大鼠增長(zhǎng)顯著，明顯大于高鈣鉛處理組(p<0.

6、05)，鉛處理和低鈣鉛處理組增長(zhǎng)量則依次低于高鈣鉛處理組(p<0.05)。其中尤以雄性大鼠的變化明顯。表明鉛染毒抑制了大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。 3．不同處理的大鼠股骨發(fā)育有著顯著的差異：與對(duì)照組和高鈣鉛處理組相比，低鈣鉛處理組的股骨短小，可輕易折斷。其股骨長(zhǎng)度及干體直徑比較如下：鉛處理組>低鈣鉛處理組，但不如對(duì)照組和高鈣鉛處理組。對(duì)照組和高鈣鉛處理組股骨外形未見(jiàn)明顯差異；低鈣鉛處理組和鉛處理組骨干厚度明顯小于對(duì)照和高鈣鉛處理組，且低鈣鉛

7、處理組最小(p<0.01)，對(duì)照組稍大于高鈣鉛處理組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；低鈣鉛處理組中骨小梁數(shù)目少且散在，骨小梁間的初級(jí)骨髓腔大而形狀不規(guī)則。對(duì)照組中骨小梁數(shù)目多并相互連接，初級(jí)骨髓腔被骨小梁分開(kāi)并具一定形狀。鉛處理組股骨骨小梁數(shù)較對(duì)照組和高鈣鉛處理組少，有部分連接在一起，但比低鈣鉛處理組骨小梁多。高倍鏡下可明顯看出，鉛處理和低鈣鉛處理組密質(zhì)骨沒(méi)有對(duì)照和高鈣鉛處理組致密。表明鉛處理影響了大鼠軟骨內(nèi)成骨作用，抑制大鼠骨骼

8、的正常發(fā)育，而補(bǔ)充鈣有助于減輕鉛對(duì)骨骼的抑制作用。 4．鉛處理組的大鼠糞便中<'45>Ca<'2+>遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組(P<0.01)，提示染鉛組大鼠體內(nèi)<'45>Ca<'2+>攝入遠(yuǎn)低于對(duì)照組。各組大鼠骨鈣含量比較結(jié)果為：對(duì)照組>高鈣鉛處理組>鉛處理組>低鈣鉛處理組，而大鼠骨骼中鉛含量結(jié)果則與之相反，雌雄均呈類(lèi)似趨勢(shì)。鉛處理組和低鈣鉛處理組雄性大鼠骨鉛水平相近，其余組間骨鈣和骨鉛差異顯著(p<0.05)，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)二者呈直線負(fù)相

9、關(guān)。激光共聚焦掃描電鏡觀察Fluo-3/AM分子探針標(biāo)記的成骨細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>熒光時(shí)發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)游離Ca<'2+>濃度在鉛作用下升高。證實(shí)鉛對(duì)體內(nèi)外鈣的吸收均有著顯著的抑制作用。 5．大鼠血液OC值在對(duì)照組中最大，其次為高鈣鉛處理組，鉛處理組列第三，均高于低鈣鉛處理組，組間差異明顯。雌雄類(lèi)似，但雄性中尤其明顯。與之相反的是，大鼠血液PTH含量則表現(xiàn)為低鈣鉛處理組中最高，其次為鉛處理組、高鈣鉛處理組和對(duì)照組。除雄性大鼠鉛處理和高

10、鈣鉛處理組外，其余大鼠各組間PTH含量差異極顯著。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，大鼠OC和PTH之間并不存在直線負(fù)相關(guān)；但作散點(diǎn)圖分析發(fā)現(xiàn)，OC和PTH之間存在負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)。PTHr1在低鈣鉛處理組中高表達(dá)，而在對(duì)照組中低表達(dá)，高鈣鉛處理組表達(dá)量高于對(duì)照組但低于鉛處理組。OC的表達(dá)趨勢(shì)與PTHr1相反，對(duì)照組和高鈣鉛處理組中OC高表達(dá)，低鈣鉛處理組中表達(dá)量極少，鉛處理組表達(dá)則稍多于低鈣鉛處理組。結(jié)果表明鉛影響了大鼠體內(nèi)骨相關(guān)蛋白及其受體的表達(dá)。

11、 6．大鼠股骨OB及UMR106細(xì)胞電鏡超微結(jié)構(gòu)顯示，鉛使兩類(lèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同程度改變，尤其是線粒體和粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)變化較大，但對(duì)于細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷則僅在高濃度時(shí)出現(xiàn)。結(jié)果表明鉛損傷了成骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。 7．鉛使UMRl06細(xì)胞貼壁性下降，OB的形態(tài)發(fā)生改變。OB和UMR106細(xì)胞ALP、Collagen Ⅰ隨鉛濃度的增加而表達(dá)減少，提示鉛影響了成骨細(xì)胞的形態(tài)及標(biāo)志物的表達(dá)；鉛降低了成骨細(xì)胞OC的分泌，并使OC的調(diào)節(jié)因子如bF

12、GF、cbfa1/osf2、c-fos和c-jun的表達(dá)減少；鉛明顯促進(jìn)p-ERK1/2的表達(dá)，ERK1/2途徑的特異性阻斷劑PD98059可使鉛對(duì)UMR106的這種作用減弱或消失，但對(duì)于總ERK1/2的表達(dá)并無(wú)影響。表明MAPK(ERK1/2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能參與了鉛對(duì)成骨細(xì)胞毒性作用的調(diào)控。 綜上所述,鉛抑制了骨骼的正常生長(zhǎng)發(fā)育，低鈣處理加劇了其作用，而適量的鈣補(bǔ)充有利于減輕鉛對(duì)于骨骼生長(zhǎng)的抑制作用。鉛對(duì)于骨骼生長(zhǎng)發(fā)育的