小型豬急性心肌梗死模型血管再生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:1.在小鼠角膜模型中，將VEGF、FGF-2和PDGF家族成員(PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-BB)兩兩組合進(jìn)行初步篩選，確定有協(xié)同促血管生成效應(yīng)的不同生長(zhǎng)因子之間的組合。 2.根據(jù)篩選結(jié)果進(jìn)一步探討最佳組合因子在小型豬心肌梗死模型中的治療效果及其可能的機(jī)制。 1.方法: 1.1 生長(zhǎng)因子組合的篩選角膜是沒(méi)有血管的組織，因此它是研究血管生成的理想模型。我們以hydron聚合體包被蔗糖硫酸鋁制作緩

2、釋系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)包載不同血管生長(zhǎng)因子使其成為緩釋劑，置入小鼠角膜。不同生長(zhǎng)因子單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用的劑量如下：FGF-2(80 ng)，VEGF(160 ng)，PDGF-AA(160 ng)， PDGF-AB(160 ng)， PDGF-BB(160 ng)，PDGF-AA(160 ng)/FGF-2(80 ng)，PDGF-AB(160 ng)/FGF-2(80 ng)，PDGF-BB(160 ng)/FGF-2(40 ng)， FGF

3、-2(80 ng)/VEGF(160 ng)，PDGF-BB(160 ng)/VEGF(160 ng)。在置入因子后5天后測(cè)定每一組動(dòng)物角膜新生血管的長(zhǎng)度和面積。為了觀察血管新生的穩(wěn)定性，在置入因子后第12，24，70天時(shí)分別再次測(cè)定血管長(zhǎng)度和面積，并觀察新生血管外形和輪廓的變化，確定有協(xié)同促血管生成作用的生長(zhǎng)因子的組合，并根據(jù)篩選結(jié)果在小型豬急性心肌梗死模型中做進(jìn)一步研究。 1.2 小型豬急性心肌梗死模型的建立以及血管生長(zhǎng)因子的導(dǎo)入中

4、國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬40只，隨機(jī)分為4組，每組10只。①PBS對(duì)照組，②FGF-2(5μg)治療組，③PDGF-BB(10μg)治療組，④FGF-2(5μg)/PDGF-BB(10μg)聯(lián)合治療組。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理均遵循中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例(N0.55，2001)和山東大學(xué)齊魯醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。 動(dòng)物經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)麻醉后建立靜脈通路，并靜脈注射3％戊巴比妥鈉維持麻醉。然后行氣管插管，呼吸機(jī)機(jī)械通氣。經(jīng)前正中線開(kāi)胸，顯露

5、冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)后，于左前降支中遠(yuǎn)端1/3處用無(wú)創(chuàng)針線預(yù)結(jié)扎(不全部阻斷血流)10min，然后完全結(jié)扎。 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后監(jiān)測(cè)心率和血壓的變化，急性心肌梗死模型構(gòu)建成功的判定指標(biāo)為：心電監(jiān)護(hù)顯示ST段弓背向上抬高持續(xù)30min以上，結(jié)扎動(dòng)脈支配區(qū)域的心肌變暗變紫，運(yùn)動(dòng)減弱。以hydron聚合體包被蔗糖硫酸鋁制作緩釋系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)包載不同血管生長(zhǎng)因子使其成為緩釋劑，包埋于心包下心肌梗死邊緣的缺血區(qū)域。 1.3 選

6、擇性冠狀動(dòng)脈造影術(shù)及評(píng)價(jià)側(cè)支循環(huán)麻醉動(dòng)物股動(dòng)脈穿刺成功后，經(jīng)股動(dòng)脈將6F導(dǎo)管送入左右冠狀動(dòng)脈行冠狀動(dòng)脈造影，用以證實(shí)觀察左前降支結(jié)扎部位血流完全阻斷，并評(píng)價(jià)LAD分布區(qū)的側(cè)支循環(huán)。側(cè)支循環(huán)指數(shù)按Rentrop分級(jí)分為0～3級(jí)：0級(jí)為冠狀動(dòng)脈系統(tǒng)無(wú)側(cè)支顯影；1級(jí)為心外膜下冠狀動(dòng)脈細(xì)小分支內(nèi)有很弱的充盈，但是心外膜主要分支內(nèi)無(wú)顯影: 2級(jí)為心外膜下冠狀動(dòng)脈主要分支部分充盈；3級(jí)為心外膜下冠狀動(dòng)脈主要分支完全充盈。 1.4 應(yīng)用彩色微粒測(cè)定局

7、部心肌血流量在治療前和治療后第6周和14周分別應(yīng)用紅色、黃色和藍(lán)色三種不同顏色的彩色微粒(直徑 10±2μm， E-Z Trac，Los Angeles，CA)來(lái)評(píng)估這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的心肌局部血流量。將5F豬尾導(dǎo)管經(jīng)股動(dòng)脈進(jìn)入左心室，經(jīng)導(dǎo)管向左心室內(nèi)注射入5 × 106個(gè)彩色微粒(將彩色微粒稀釋于10ml生理鹽水中)，注射時(shí)間為30s，然后用10ml生理鹽水沖洗導(dǎo)管。在注射彩色微粒前10s，使用定速抽血泵由股動(dòng)脈抽取參考血液樣本，抽取速率為

8、10ml/min，共90s。血樣-20℃保存。根據(jù)公司提供的操作步驟回收并計(jì)數(shù)組織和參考血樣中的彩色微粒。根據(jù)公式計(jì)算心肌局部血流量：Qm=(Cm × Qr)/Cr。其中，Qm是指每克心肌組織的血流量(ml/min/g)，Cm是指每克心肌組織的彩色微粒數(shù)，Qr是指參考血樣的抽取速度(ml/min)，Cr是指參考血樣中的彩色微粒數(shù)。 1.5 超聲心動(dòng)圖測(cè)定左心室整體和局部收縮功能將動(dòng)物于開(kāi)胸狀態(tài)下行心外膜超聲檢測(cè)。在心尖兩腔和四腔

9、心切面采以校正的Simpson's方法測(cè)定左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。在二維灰階圖像上分別測(cè)定梗死邊緣的缺血區(qū)左心室舒張末期(心電圖R波峰值處)和收縮末期(心電圖T波末端)的室壁厚度，按以下公式計(jì)算缺血心肌局部室壁增厚率(wall thickening，WT)：WT=(收縮末室壁厚度-舒張末室壁厚度)/舒張末室壁厚度× 100％ 1.6治療效果評(píng)價(jià)心臟缺血區(qū)導(dǎo)入生長(zhǎng)因子6周后，進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影和彩色微粒注射分別評(píng)價(jià)側(cè)支循環(huán)和局部

10、心肌血流量；導(dǎo)入生長(zhǎng)因子14周后，再次行冠狀動(dòng)脈造影、彩色微粒注射和超聲心動(dòng)圖檢查來(lái)評(píng)價(jià)側(cè)支循環(huán)、心肌灌注以及左室整體和缺血區(qū)局部功能。 1.7 免疫組化于第14周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉狀態(tài)下靜脈注射氯化鉀處死所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取出心臟，將左心室LAD結(jié)扎遠(yuǎn)端的缺血心肌分別置于多聚甲醛和液氮中備用，行相關(guān)組織學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)。 新生血管的密度測(cè)定方法：缺血區(qū)組織以多聚甲醛浸泡固定、石蠟包埋，切片厚度5 μm。通過(guò)兔多克隆抗體vo

11、n Willebrand factor(νWF)和小鼠單克隆抗體α-smooth muscle actin(α-SMA)免疫組化標(biāo)記缺血區(qū)心肌的新生毛細(xì)血管和小動(dòng)脈，并用熒光雙標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)新生血管的成熟程度和穩(wěn)定性。這里我們引入了一個(gè)參數(shù)：成熟指數(shù)(mafuration index)，即被平滑肌包被的新生血管所占所有血管的百分比。 1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在做分析之前

12、，對(duì)所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。連續(xù)變量應(yīng)用2×2析因設(shè)計(jì)和重復(fù)測(cè)量的方差分析。不同時(shí)間點(diǎn)連續(xù)變量應(yīng)用重復(fù)測(cè)量的方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較應(yīng)用LSD或Dunnutt T3(方差不齊時(shí))以及多元方差分析進(jìn)行。等級(jí)資料用非參數(shù)檢驗(yàn)分析，多組之間的比較用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，組間兩兩比較Mann-Whitney檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.結(jié)果: 2.1 小鼠角膜模型血管生長(zhǎng)因子的篩選將不同生長(zhǎng)因子緩

13、釋劑置入角膜第5天時(shí)檢測(cè)結(jié)果表明，無(wú)論單獨(dú)應(yīng)用一種還是聯(lián)合兩種生長(zhǎng)因子均可誘導(dǎo)角膜新生血管的形成。與單一因子比較， VEGF/FGF-2和VEGF/PDGF-BB這兩種因子組合無(wú)顯著協(xié)同作用。而FGF-2和PDGF家族成員PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-BB聯(lián)合應(yīng)用均有顯著的協(xié)同促血管生成效應(yīng)。但是到了第70天，聯(lián)合應(yīng)用FGF-2和PDGF-AA組誘導(dǎo)的血管幾乎完全退化，而FGF-2與PDGF-AB或PDGF-BB協(xié)同誘導(dǎo)的新

14、生血管得以維持。因此，我們選擇了協(xié)同促血管生成作用最強(qiáng)的生長(zhǎng)因子組合(FGF-2和PDGF-BB)在小型豬急性心肌梗死模型中作進(jìn)一步研究。 40只實(shí)驗(yàn)用小型豬，第一次手術(shù)時(shí)死亡5只，其中2只死于麻醉意外，3只于結(jié)扎LAD時(shí)死于心室顫動(dòng)。第二次冠狀動(dòng)脈造影時(shí)1只動(dòng)物死于麻醉意外。共有34只小型豬完成了整個(gè)實(shí)驗(yàn)。 2.2 冠狀動(dòng)脈造影評(píng)估側(cè)支指數(shù)的變化第一次手術(shù)時(shí)四組動(dòng)物的側(cè)支指數(shù)均為0，第6周時(shí)側(cè)支指數(shù)在四組之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

15、(Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，P=0.026)。進(jìn)一步組間比較發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用FGF-2/PDGF-BB組的側(cè)支指數(shù)較單獨(dú)應(yīng)用FGF-2、PDGF-BB或PBS對(duì)照組均顯著增高(P值分別為0.037，0.021和0.002)，在結(jié)扎的冠狀動(dòng)脈遠(yuǎn)端形成可顯影的側(cè)支血管網(wǎng)絡(luò)。與基礎(chǔ)值相比，單獨(dú)應(yīng)用FGF-2治療也可使缺血區(qū)側(cè)支指數(shù)增加(P=0.0 18)。單獨(dú)應(yīng)用PDGF-BB治療后雖然側(cè)支指數(shù)有增加趨勢(shì)，但差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0

16、.058)。而PBS對(duì)照組無(wú)明顯側(cè)支血管生成。 2.3 彩色微粒測(cè)定局部心肌血流量的變化治療前各組心肌血流量無(wú)差別，治療后第6周和第14周，各組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。組間比較表明，F(xiàn)GF-2/PDGF-BB聯(lián)合應(yīng)用組較單獨(dú)應(yīng)用一種生長(zhǎng)因子及PBS對(duì)照組心肌血流量顯著增加(6周，P＜0.01；14周，P＜0.01)。析因設(shè)計(jì)的方差分析發(fā)現(xiàn)FGF-2和PDGF-BB之間有正交互作用(6周，F(xiàn)=7.317，P=0.011

17、；14周，F(xiàn)=4.930，P=0.034)。第14周的結(jié)果較第6周時(shí)的結(jié)果無(wú)顯著差異。 2.4 左心室整體和局部功能的變化治療后第14周，F(xiàn)GF-2/PDGF-BB聯(lián)合治療組的左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)較對(duì)照組顯著增高(P=0.034)，但是與單獨(dú)應(yīng)用FGF-2或PDGF-BB比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.10和0.082)。單獨(dú)應(yīng)用FGF-2或PDGF-BB較對(duì)照組LVEF亦無(wú)顯著性改變。治療前各組間缺血區(qū)室壁增厚率無(wú)差