腺病毒介導人β-,2--腎上腺素受體在兔慢性缺氧心肌細胞的表達及細胞保護作用的實驗研究.pdf

1、目的： 通過腺病毒介導的β2-腎上腺素受體(β2-AR)基因轉(zhuǎn)染紫紺型心臟病動物模型(CCM)兔心肌細胞，探討β2-AR基因轉(zhuǎn)染對慢性缺氧心肌細胞的保護作用。 方法： 1.重組Ad.β2-AR腺病毒擴增： 采用50％組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)測定病毒滴度，熒光顯微鏡檢測病毒轉(zhuǎn)染率，Western blot檢測HEK293細胞中β2-AR蛋白表達。 2.建立紫紺型心臟病動物模型： 采

2、用外科手術(shù)的方法，將成年新西蘭大白兔的主肺動脈與左心耳吻合，建立右向左分流紫紺型心臟病動物模型。 3.分離培養(yǎng)心肌細胞及β2-AR基因轉(zhuǎn)染： 應(yīng)用Langendorff逆向灌注膠原酶消化，分離成年兔心肌細胞，進行體外原代培養(yǎng)。心肌細胞分為5組：①正常組(Control)：分離正常成年兔心肌細胞，培養(yǎng)48h。②假手術(shù)組(Sham)：分離假手術(shù)組兔心肌細胞，培養(yǎng)48h。⑧紫紺型心臟病模型組(CCM)：分離紫紺型動物模型兔心肌

3、細胞，培養(yǎng)48h。④轉(zhuǎn)GFP組(Ad.GFP)：分離紫紺型動物模型，轉(zhuǎn)染GFP基因的心肌細胞，培養(yǎng)48h。⑤轉(zhuǎn)β2-AR組(Ad.β2-AR)：分離紫紺型動物模型，轉(zhuǎn)染β2-AR基因心肌細胞，培養(yǎng)48h。 4.Ad.β2-AR轉(zhuǎn)染細胞保護作用檢測 Western blot檢測實驗各組心肌細胞中β2-AR蛋白表達；檢測Caspase-3蛋白、p-AKT和p-ERK的蛋白表達。 結(jié)果： 1.擴增后Ad.GFP

4、滴度為3.16×1010pfu/ml，Ad.β2-AR滴度為3.98x1010pfu/ml。Western Blot測定顯示，HEK293細胞感染Ad.β2-AR后，β2-AR蛋白表達為對照組的5.6倍。 2.建模5周后，動脈血氣分析測定顯示，紫紺型兔動物模型PO2(45.3±3.7)及SaO2(75.7±6.5)均較正常兔顯著降低(P<0.01)。 3.Ad.β2-AR轉(zhuǎn)染紫紺型動物模型兔心肌細胞，培養(yǎng)48h病毒感染率

5、最高。與紫紺組相比，轉(zhuǎn)β2-AR組心肌細胞存活率顯著升高(35.36±6.35 vs 44053±6.67)(P<0.01)。 4.Western Blot測定顯示，轉(zhuǎn)β2-AR基因組β2-AR蛋白表達高于紫紺組約3倍(P<0.01)；p-AKT和p-ERK蛋白表達較紫紺組增加約2倍，Caspase-3蛋白表達為紫紺組0.65倍；轉(zhuǎn)β2-AR組β2-AR蛋白表達與正常組及假手術(shù)組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。