PEA3和GDNF在小鼠結腸肌間神經叢的表達及意義的研究.pdf

1、腸神經系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)是由位于胃腸道壁(包括胰和膽囊)內的神經元、神經遞質和蛋白質及其支持細胞所組成的系統(tǒng)，這些神經元起源于神經嵴組織。位于消化道壁內的神經系統(tǒng)主要由2組神經元及其纖維網交織而成，分別是位于縱行肌與環(huán)行肌之間的肌間神經叢(auerbach plexus)和位于粘膜層與環(huán)行肌之間的粘膜下神經叢(meissner plexus)。前者主要與腸道的運動有關,后者主要與腸道的分泌、吸收

2、功能有關。當肌間神經叢發(fā)育障礙時，腸道運動功能不良，可導致便秘等多種臨床癥狀和疾病，如先天性巨結腸(Hirchsprung’s disease，HD) 。 多瘤促活化因子(Polymoma virus enhancer-3，PEA3)基因屬于ETS轉錄因子基因家族，其編碼生成的蛋白在神經嵴細胞的遷移與分化過程中發(fā)揮功能，尤其在運動神經元的遷移、分化和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。有研究表明，PEA3是膠質細胞源性神經生長因子（glia

3、l cell line-derived neurotrophic factor GDNF）的下游作用靶，在GDNF發(fā)揮作用中是一個重要因素，在PEA3和GDNF突變型中均觀察到相似的神經細胞遷移障礙。同時，以往的研究發(fā)現(xiàn)，GDNF表達缺陷使神經前體細胞過早調亡引起腸神經系統(tǒng)的異常，是HD發(fā)病的一個重要因素。SOX-10基因是HD發(fā)病的敏感基因之一，基因敲除的小鼠表現(xiàn)出HD的多種臨床癥狀。但PEA3蛋白在HD和HAD(先天性巨結腸同源病)

4、的發(fā)病過程中是否發(fā)揮作用，目前還沒有相關報道。用免疫組織化學的方法系統(tǒng)探討PEA3、GDNF蛋白在小鼠結腸肌間神經叢發(fā)育過程中的表達及相關性；探討PEA3蛋白在SOX-10基因敲除小鼠結腸肌間神經叢的表達變化；為進一步探討HD和HAD的病因提供實驗依據。 本實驗分兩個部分對HD和HAD的發(fā)病機制進行研究： 第一部分采取成年健康雌性昆明小鼠13只，體重50～60g，與體重80g證實有生育能力的雄性昆明小鼠按一雄一雌于下午四

5、時合籠進行交配，于每天清晨檢查發(fā)現(xiàn)雌鼠陰道有陰栓者或鏡檢有大量精子者為交配成功，定為孕1天。分別在孕10、14、19天小鼠各1例取其胚胎結腸組織，石蠟包埋，每一例蠟塊每連續(xù)切片5張留1張，片厚6微米。免疫組織化學方法：分別以兔抗鼠PEA3單克隆抗體（由SANTA CRUZ公司提供，稀釋度1:400）、兔抗鼠GDNF單克隆抗體（由博士德公司提供，稀釋度1:100）為一抗，運用免疫組織化學SABC方法，DAB染色。以PBS代替第一抗血清作對

6、照，結果染色陰性。觀察PEA3和GDNF蛋白在小鼠結腸肌間神經叢發(fā)育過程中的分布，探討其與HD腸動力障礙發(fā)生的關系。 第二部分取SOX-10基因敲除小鼠5只分別取其升結腸、乙狀結腸，石蠟包埋，取正常小鼠1只作為對照。每一例蠟塊做連續(xù)切片3張，片厚6微米，依次編號為1、2、3。第一張切片行HE染色，第二張切片行免疫組化染色，第三張切片作甲苯胺藍特染。免疫組織化學方法同第一部分。觀察PEA3蛋白在正常小鼠與SOX-10基因敲除小鼠結

7、腸肌間神經叢分布的差異，以進一步闡述HD腸動力障礙的發(fā)病機制。 實驗結果： 第一部分實驗中，觀察到PEA3、GDNF蛋白表達光密度平均值在結腸發(fā)育早期較低，GDNF蛋白表達在胚胎發(fā)育中期達到峰值，在結腸發(fā)育后期下降。PEA3蛋白的表達則隨胎齡的增加而增加，且二者在早期和中期不同胚齡小鼠結腸中的表達變化具有一致性。 第二部分的實驗中，觀察到在基因敲除小鼠升結腸肌間神經叢中，PEA3陽性細胞數量較正常組變化不明顯，細

8、胞中PEA3陽性顆粒的含量減少；在乙狀結腸肌間神經叢中觀察到PEA3陽性細胞數量較正常組略有下降（P〈0.05），細胞中PEA3陽性顆粒的含量減少。光密度分析結合統(tǒng)計學分析得出PEA3在基因敲除組與正常組中的表達差異具有顯著的統(tǒng)計學意義（P〈0.01）。 結果提示：在結腸肌間神經叢發(fā)育的早期及中期PEA3和GDNF蛋白的表達變化具有一致性，并且GDNF可能作為PEA3的上游基因表達產物影響其在小鼠結腸發(fā)育過程中的表達，PEA3表