SSH分離鑒定大鼠腎臟發(fā)育基因，Pea3基因在大鼠腎臟發(fā)育中的表達(dá)及意義.pdf

1、為了更好地探討腎臟后期發(fā)育的分子機(jī)制，本研究利用生后發(fā)育這個(gè)時(shí)間窗口，從腎臟后期發(fā)育角度出發(fā)來(lái)篩選腎臟發(fā)育相關(guān)基因。 第一部分大鼠腎臟發(fā)育相關(guān)基因差減文庫(kù)的構(gòu)建及驗(yàn)證 目的：分離大鼠腎臟發(fā)育相關(guān)基因，構(gòu)建雙向差減文庫(kù)并驗(yàn)證。 方法：分別以新生大鼠腎臟組織為檢測(cè)組(tester)、生后21天腎臟為驅(qū)逐組(driver)，進(jìn)行正向SSH；以生后21天腎臟為tester、新生大鼠腎臟組織為driver，進(jìn)行反向SSH。

2、經(jīng)過(guò)總RNA的提取、mRNA的純化、反轉(zhuǎn)錄、酶切、接頭連接、2輪差減雜交和2輪PCR，獲得正、反向差減雜交產(chǎn)物，將其克隆入質(zhì)粒表達(dá)載體pGEM~-TEasy載體，轉(zhuǎn)入XL2-BlueMRF'UitracompetentCells以擴(kuò)增，克隆，測(cè)序，生物信息學(xué)分析，并隨機(jī)挑選部分基因用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證其差異表達(dá)。 結(jié)論：RT-PCR所驗(yàn)證基因的表達(dá)趨勢(shì)與差減文庫(kù)表達(dá)譜趨勢(shì)一致，提示所構(gòu)建文庫(kù)的可靠性和可信度。該差減文庫(kù)為進(jìn)一步

3、研究腎臟發(fā)育提供了一個(gè)良好的平臺(tái)。 第二部分Pea3基因在大鼠腎臟不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)及意義 目的：驗(yàn)證Pea3(Polyomavirusenhanceractivator3)基因的差異表達(dá)，并分析該基因在整個(gè)腎臟發(fā)育不同時(shí)期的時(shí)空表達(dá)規(guī)律。 方法：應(yīng)用RT-PCR、WesternBlot、原位雜交技術(shù)檢測(cè)不同發(fā)育時(shí)期大鼠腎臟組織Pea3基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。 結(jié)論：隨著大鼠腎臟組織的不斷成熟，

4、Pea3基因表達(dá)逐漸下調(diào)，提示該基因可能參與腎臟的發(fā)生發(fā)育，其主要表達(dá)在輸尿管芽分枝端和濃縮的后腎間充質(zhì)上，提示該基因可能參與腎臟發(fā)育中上皮-基質(zhì)之間的相互誘導(dǎo)發(fā)育過(guò)程。 本課題的特征和創(chuàng)新之處在于：(1)本文采用SSH技術(shù)首次對(duì)新生大鼠和生后21天大鼠腎臟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)譜特征進(jìn)行了初步研究，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得了多個(gè)有意義的差異表達(dá)基因。(2)首次觀察Pea3基因從胚胎到成年大鼠腎臟組織中的時(shí)空表達(dá)情況，