PI-3K、DGAT-,2-、PKC-ε在大鼠非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機制的作用研究.pdf

1、目的:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty livcr disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明確的肝損傷因素所致的,以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征,包括單純性脂肪性肝病以及由其演變的脂肪性肝炎和肝硬化[1-2]；目前,NAFLD的具體發(fā)病機制并不是十分清楚,是一種代謝應激性肝損傷,其與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關[3-5]。本實驗旨在通過改良高脂飲食建立非酒精性脂肪性肝病大鼠模型,

2、通過時間點的變化來研究磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI-3K)、二酰甘油酰基轉移酶2(AcylCoA:DiacylgycerolAcyltransferase-2,DGAT2)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的亞型PKC-ε在脂肪肝的表達量的變化,從而進一步探索NAFLD的發(fā)病機制。
　　 方法:健康成年雄性Spague-Dawlay(SD)大鼠48只(1

3、50-180g),按隨機表法隨機分為2組,設立4、8、12周高脂喂養(yǎng)模型組(H組),并設立同時相正常喂養(yǎng)組(N組)作為對照,每組8只。正常飲食組給予基礎飼料(瀘州醫(yī)院實驗動物中心提供),模型組給予高脂飲食(即制備的改良高脂飼料:膽固醇含2％,膽酸鈉含0.5％,丙硫氧嘧啶含0.2％,蔗糖含5％,豬油含10％,基礎飼料含82.3％[6]),兩組飲料均為自來水,自由飲用。造模4、8、12周末時分別處死對照組及模型組大鼠各8只,心臟采血,測量大

4、鼠的血清轉氨酶(AST、ALT)以及膽固醇(TC),以觀察大鼠非酒精性脂肪性肝病模型肝脂變進展；然后迅速取出肝臟稱肝濕重,計算肝指數:肝濕質量/體質量×100％。取肝組織標本,制備石蠟切片,行蘇木精-伊紅(HE)染色觀察肝組織光鏡下的病理改變,并觀察肝臟脂肪變程度；免疫組織化學法檢測PKC-ε在肝組織中的表達情況；實時熒光定量PCR法(real-time quantitativePCR)檢測肝臟PI-3K mRNA以及DGAT2 mRN

5、A的表達。計量資料用均數±標準差((x)+SD)表示,采用t檢驗,組間比較采用方差分析,方差齊者采用單因素方差分析,方差不齊者采用H檢驗,比較模型組與對照組及模型組間在血清學、病理學等指標的差別,P<0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:1.血清生化學指標:(1)肝功能和血脂:模型組AST、ALT和TC隨著造模時間的逐漸延長與正常組相比明顯升高。2.病理學觀察:(1)肝臟大體觀察:肉眼可見大鼠正常組肝臟呈鮮紅色；與之比較模型組肝臟

6、肉眼觀即可出現肝臟顏色變黃,有油膩感,肝臟體積增大。(2)組織學觀察:正常組大鼠肝小葉結構清晰,肝竇網狀纖維疏松。模型組4、8、12周動物肝組織出現中至重度肝細胞脂肪變性,隨造模時間延長脂肪變程度、氣球樣變以及纖維化程度逐漸加重,均高于對照組(P<0.05)。NAFLD病理改變中脂肪變性、肝細胞氣球樣變、小葉內炎癥和纖維化發(fā)生普遍,并且脂肪變性與小葉內炎癥、纖維化及肝細胞氣球樣變程度間呈正相關關系。3.PKC-ε免疫組織化學法的表達:對

7、照組肝臟中呈散在分布,胞漿內著色,弱陽性。模型組PKC-ε在肝臟的細胞膜及細胞漿內呈明顯的棕黃色陽性表達,隨著時間的延長,棕黃色的陽性表達逐漸加深,并呈片狀分布,分布的范圍越廣,且表達量較正常對照組明顯增加。造模4周時,肝細胞著色較正常組深,散在分布。造模8周時,棕黃色顆粒在陽性細胞的表達加深,分布較密集,陽性細胞增多。造模12周時,可見陽性細胞增加,棕黃色表達進一步加深,呈彌漫、大片分布。4.熒光定量PI-3K mRNA及DGAT2

8、mRNA在肝組織的表達:PI-3K mRNA在模型組隨著脂肪變、纖維化、炎癥程度的加重,表達量逐漸減少且模型組各組之間與正常組表達量相比明顯減少(P<0.05);DGAT2 mRNA在模型組隨著肝脂肪變、纖維化、炎癥程度的加重,表達量逐漸上升且模型組各組之間與正常組表達量相比呈顯著增加(P<0.05)。
　　 結論:1.PI-3K(p85a)mRNA表達隨著NAFLD的肝脂肪變程度加重,其表達量逐漸降低,PI-3K(p85a)m