免疫負(fù)調(diào)控基因A20在人原發(fā)性肝癌中的表達(dá)狀態(tài)和所起作用的研究.pdf

1、目的：
　　 肝細(xì)胞肝癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)為全球第五大常見的癌癥，位于死亡相關(guān)癌癥的第三位，由于其較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移性和較高的術(shù)后復(fù)發(fā)率，目前仍缺乏有效的治療方法，術(shù)后3年內(nèi)的存活率小于13％。
　　 免疫負(fù)調(diào)控基因A20，作為腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3的基因，通過抑制細(xì)胞凋亡參與腫瘤的惡性進(jìn)展過程，人A20蛋白與小鼠A20蛋白的同源性高達(dá)98％，其N端的OUT區(qū)域可與泛素結(jié)合，發(fā)揮去泛素化

2、酶的作用，其C端的鋅指結(jié)構(gòu)域具有泛素化功能。A20雙重泛素化編輯作用，可以使NF-κB信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子RAF6發(fā)生去泛素化及RIP1發(fā)生泛素化進(jìn)而降解，因而A20可以抑制多種炎性因子的產(chǎn)生和分泌。已有研究表明，A20缺陷小鼠，容易發(fā)生不可控制的慢性炎癥和多器官的組織損傷，出生不久后就死亡。另外，A20與人類疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，如炎癥性腸炎、過敏性哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、B細(xì)胞淋巴癌等。目前，關(guān)于A20在腫瘤轉(zhuǎn)移侵

3、襲方面的研究還不是很多，特別是在肝癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移方面的研究還未見報(bào)道。
　　 本課題則致力于研究A20在肝癌發(fā)生發(fā)展及其轉(zhuǎn)移中所起的作用，并進(jìn)一步研究其發(fā)生作用的分子機(jī)制，探究治療肝癌的新靶點(diǎn)，為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 一、采用免疫組化的方法，檢測A20在肝癌病人癌組織以及癌旁組織中的表達(dá)情況
　　 (1)肝癌病理組織切片的獲取
　　 本課題研究所用的46例肝癌病人腫瘤

4、標(biāo)本的連續(xù)切片來自齊魯醫(yī)院病理科。病人的年齡、性別、分級(jí)分化、TNM分期、腫瘤大小資料均來自臨床病歷記錄。
　　 (2)免疫組化技術(shù)檢測A20在肝癌病人癌組織和癌旁組織中的表達(dá)
　　 采用免疫組織化學(xué)的方法，對(duì)A20基因在肝癌病人癌組織和癌旁組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測，A20一抗為兔抗人，稀釋比例為1∶400，二抗為山羊抗兔，稀釋比例為1∶1000，一抗4℃過夜，DAB試劑盒顯色，細(xì)胞核用蘇木素復(fù)染，并設(shè)立不加一抗的陰性對(duì)照組

5、。
　　 二、構(gòu)建A20真核表達(dá)載體
　　 (1)構(gòu)建A20真核表達(dá)載體并進(jìn)行陽性克隆挑選
　　 采用A20目的基因與pRK5-Basic載體雙酶切后直接連接的方法，用LA平板37℃培養(yǎng)過夜，抗性篩選陽性克隆，經(jīng)菌落PCR和雙酶切鑒定陽性重組子正確后，抽提質(zhì)粒樣本送于博尚公司測序。
　　 (2)RT-PCR和Westernblot方法檢測A20在肝癌細(xì)胞的表達(dá)情況
　　 A20測序正確后以脂質(zhì)體法

6、轉(zhuǎn)染至SMMC-7721肝癌細(xì)胞系中，24h后用Trizol試劑提取總RNA，采用RT-PCR方法檢測A20在mRNA上的表達(dá);48h后收取蛋白采用Westernblot方法檢測A20在蛋白上的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　 三、細(xì)胞劃痕試驗(yàn)粗略檢測A20對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞遷移的影響
　　 取12孔板，并在每排板中央劃一橫線作為標(biāo)記，依規(guī)定濃度種板并轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6h后用10μl槍頭垂直于橫線劃痕，細(xì)胞用PBS清洗三

7、次后換無血清培養(yǎng)基RPIM1640繼續(xù)培養(yǎng)，分別取0h、24h、48h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)拍照。將0h的劃痕距離分別與24h后劃痕距離和48h后劃痕距離相減得出細(xì)胞在24h和48h時(shí)間段內(nèi)的遷移距離。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。該實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染pRK5-Basic質(zhì)粒組，轉(zhuǎn)染pRK5-A20質(zhì)粒組。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。
　　 四、Transwell實(shí)驗(yàn)精確檢測A20對(duì)BEL-7402肝癌細(xì)胞遷移的影響
　　 取0.4μm的T

8、ranswell小室，置于12孔板，板中預(yù)先加有600μl含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，小室內(nèi)加入200μl轉(zhuǎn)染后規(guī)定濃度的BEL-7402細(xì)胞，BEL-7402細(xì)胞用含0.1％BSA的無血清培養(yǎng)基RPMI1640重懸混勻，培養(yǎng)12h后結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下選取區(qū)域?qū)Υ┻^小孔的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染pRK5-Basic質(zhì)粒組，轉(zhuǎn)染pRK5-A20質(zhì)粒組。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

9、　　 五、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測A20對(duì)BEL-7402肝癌細(xì)胞侵襲的影響
　　 具體操作同Transwell實(shí)驗(yàn)（上），不同之處為在接種細(xì)胞前，按照Matrigel膠和RPMI1640培養(yǎng)液1∶3比例，即可用50μlMatrigel預(yù)先將Transwell小室鋪膠置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，待凝固后，加入150μl轉(zhuǎn)染后規(guī)定濃度的BEL-7402細(xì)胞懸液。
　　 六、CCK8實(shí)驗(yàn)檢測A20對(duì)肝癌細(xì)胞增值作用的影響
　　 BE

10、L-7402和SMMC-7721肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，消化，以濃度5×105個(gè)/ml、100μl/孔接種于96孔板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在24h、48h、72h時(shí)間點(diǎn)取出，按CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)說明書，檢測其在450nm處的吸光度，并將所得數(shù)據(jù)用GraphPadPrism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染pRK5-Basic質(zhì)粒組，轉(zhuǎn)染pRK5-A20質(zhì)粒組，每組加入96孔板的10個(gè)孔。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 七、

11、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測A20對(duì)肝癌細(xì)胞增殖作用的影響
　　 BEL-7402和SMMC-7721肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，消化，用含10％FBS的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，分別以濃度1×103個(gè)/ml、5×103個(gè)/ml，2ml/孔接種于6孔板中，將其在細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周，觀察克隆形成情況，結(jié)晶紫染色。每孔選取10個(gè)不同區(qū)域在200×顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆形成的數(shù)目。并將所得數(shù)據(jù)做用GraphPadPrissm5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)

12、驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染pRK5-Basic質(zhì)粒組，轉(zhuǎn)染pRK5-A20質(zhì)粒組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 八、RT-PCR方法檢測A20真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞后，E-cadherin和MMP9在mRNA水平上的表達(dá)變化
　　 SMMC-7721肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR方法檢測E-cadherin和MMP9在mRNA水平上的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染p

13、RK5-Basic質(zhì)粒組，轉(zhuǎn)染pRK5-A20質(zhì)粒組。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 結(jié)果：
　　 一、免疫組化結(jié)果顯示A20在肝癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，并且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 二、成功構(gòu)建A20真核表達(dá)載體，并在SMMC-7721肝癌細(xì)胞中獲得高表達(dá)。
　　 三、細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果粗略顯示A20對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移可能起到一定的抑制作用，進(jìn)一步精確的Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測結(jié)果顯示A2

14、0對(duì)BEL-7402肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲有抑制作用。
　　 四、CCK8實(shí)驗(yàn)顯示A20對(duì)BEL-7402肝癌細(xì)胞的增殖無明顯影響，進(jìn)一步克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示A20無論是對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞還是對(duì)BEL-7402肝癌細(xì)胞均有促進(jìn)增殖的作用，并且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 五、RT-PCR方法檢測在轉(zhuǎn)染A20后，SMMC-7721肝癌細(xì)胞在mRNA水平上E-cadherin的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，而MMP9的表達(dá)水平降

15、低。
　　 結(jié)論：
　　 一、A20在肝癌組織中異常表達(dá)，即相比于肝癌旁組織其在癌組織中的表達(dá)降低，提示其與肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展起到抑制作用。
　　 二、A20具有抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用，并且這種抑制作用可能是通過降低MMP9的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。
　　 創(chuàng)新性和意義：
　　 本研究首次得出結(jié)論免疫負(fù)調(diào)控基因A20與肝癌的發(fā)生發(fā)展有密切的聯(lián)系，并且研究了A20在肝癌