靶向乏氧微環(huán)境喜樹(shù)堿類(lèi)衍生物HCNO-YCS-O3對(duì)肺癌A549細(xì)胞抑制作用研究.pdf

1、第一部分:HCNO-YCS-03體外抑瘤活性和乏氧選擇性研究
　　 目的:
　　 HCNO-YCS-03是一種喜樹(shù)堿(camptothecin，CPT)類(lèi)衍生物，該衍生物在喜樹(shù)堿類(lèi)藥物拓?fù)涮婵?topotecin，TPT)1號(hào)位點(diǎn)加載乏氧觸發(fā)器氮氧結(jié)構(gòu)。在乏氧環(huán)境下，HCNO-YCS-03可有效還原激活，發(fā)揮殺滅腫瘤作用。本研究應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)，研究HCNO-YCS-03體外抑瘤活性及乏氧選擇性。

2、　　 方法:
　　 應(yīng)用TPT作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，MTT法測(cè)定HCNO-YCS-03對(duì)人源性肺癌A549細(xì)胞、胰腺癌Panc-1細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞和胃癌SGC-7901細(xì)胞在常氧和乏氧兩種環(huán)境下抑制作用，比較體外抑制作用強(qiáng)度及乏氧選擇性。選擇合適的瘤株，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺癌A549細(xì)胞在不同培養(yǎng)時(shí)間和不同藥物濃度下凋亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT法篩選:HCNO-YCS-03在常氧環(huán)境下對(duì)A54

3、9，Panc-1，SGC-7901和HepG2細(xì)胞IC50值分別為16.1±1.6μg/ml，11.5±0.9μg/ml，21.5±3.8μg/ml，15.8±2.2μg/ml;HCNO-YCS-03在乏氧環(huán)境下對(duì)這4株腫瘤株的IC50值分別為3.3±0.5μg/ml，4.1±0.7μg/ml，16.7±3.4μg/ml，9.0±1.4μg/ml;TPT在常氧環(huán)境下對(duì)這4株腫瘤株的IC50值分別為2.9±0.3μg/ml，2.2±1.0

4、μg/ml，26.5±5.9μg/ml，8.4±1.7μg/ml;TPT在乏氧環(huán)境下對(duì)這4株腫瘤株的IC50值分別為2.0±0.6μg/ml，1.9±0.3μg/ml，17.5±4.7μg/ml，6.8±0.9μg/ml。上述數(shù)據(jù)說(shuō)明HCNO-YCS-03在體外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用，尤其對(duì)A549細(xì)胞，HCNO-YCS-03具有明顯乏氧選擇性，其常氧、乏氧環(huán)境下IC50值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異p＜0.05，細(xì)胞毒作用與陽(yáng)性藥物TPT相當(dāng)。

5、
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):乏氧環(huán)境下，1μg/ml、4μg/ml和16μg/mlHCNO-YCS-03作用于A(yíng)549細(xì)胞24h細(xì)胞凋亡率分別為(31.3±3.7)％、(49.3±4.2)％和(65.7±5.7)％，4μg/mlHCNO-YCS-03作用12、24和48h的凋亡率分別為(22.9±3.4)％、(49.3±4.2)％和(58.6±4.9)％，與空白對(duì)照組(12.4±1.7)％的細(xì)胞凋亡率相比，隨著藥物濃度和給藥時(shí)間

6、延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率顯著增加p＜0.05。而在常氧環(huán)境下，1μg/ml、4μg/ml和16μg/mlHCNO-YCS-03作用24h的凋亡率分別為(17.4±2.5)％、(21.9±2.1)％和(28.6±3.2)％，4μg/mlHCNO-YCS-03作用12、24和48h的凋亡率分別為(13.4±2.8％)、(21.9±2.1)％和(26.3±3.0)％，與空白對(duì)照組(10.2±1.3)％的凋亡率相比，隨著藥物濃度和給藥時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡

7、率也顯著增加p＜0.05，但增加幅度不如乏氧環(huán)境下顯著。說(shuō)明HCNO-YCS-03對(duì)肺癌A549細(xì)胞具有很好乏氧選擇性，并且對(duì)A549細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性。
　　 結(jié)論:
　　 1、HCNO-YCS-03在體外對(duì)肺癌A549細(xì)胞、胰腺癌Panc-1細(xì)胞、胃癌SGC-7901細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞均有一定細(xì)胞毒性，尤其對(duì)肺癌A549細(xì)胞的毒性作用最強(qiáng)，其IC50值與陽(yáng)性藥物TPT相當(dāng);
　　 2、HC

8、NO-YCS-03具有很好的乏氧選擇性;
　　 3、HCNO-YCS-03對(duì)肺癌A549細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性;
　　 第二部分:HCNO-YCS-03體內(nèi)抑瘤活性、HIF-1α活性影響及毒副作用研究
　　 目的:
　　 研究HCNO-YCS-03體內(nèi)抗肺癌A549細(xì)胞活性、A549細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α）表達(dá)的影響及藥物的毒副作用

9、。
　　 方法:
　　 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A(yíng)549細(xì)胞，用生理鹽水重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107/ml。取4-6周齡裸鼠，每只右側(cè)腋窩皮下注射0.2ml細(xì)胞懸液，建立A549移植瘤模型。建模第12天移植瘤體積100±20mm3時(shí)，隨機(jī)分為四組:空白對(duì)照組（生理鹽水）、低劑量組(HCNO-YCS-035mg/kg)、高劑量組(HCNO-YCS-0310mg/kg)和陽(yáng)性對(duì)照組(TPT2mg/kg)，分別予以生理鹽水、HCNO-

10、YCS-035mg/kg、HCNO-YCS-0310mg/kg和TPT2mg/kg腹腔給藥進(jìn)行干預(yù)，評(píng)估HCNO-YCS-03對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制作用。切取腫瘤組織行組織切片檢查，TUNEL法檢測(cè)HCNO-YCS-03對(duì)腫瘤組織細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。免疫組化法檢測(cè)HCNO-YCS-03對(duì)HIF-1α的影響。同時(shí)對(duì)干預(yù)結(jié)束荷瘤鼠行血液學(xué)檢查，以檢測(cè)HCNO-YCS-03毒副作用。
　　 結(jié)果:
　　 1.荷瘤鼠腫瘤抑制作用觀(guān)測(cè)HCN

11、O-YCS-03兩劑量組荷瘤鼠體重與空白對(duì)照組無(wú)明顯差別，而陽(yáng)性對(duì)照組荷瘤鼠體重明顯低于其他三組p＜0.05。高劑量組荷瘤鼠中位生存期明顯大于空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組p＜0.05，而陽(yáng)性對(duì)照組中位生存期與空白對(duì)照組幾乎相同。這些說(shuō)明，HCNO-YCS-03的毒副作用明顯低于TPT。
　　 空白對(duì)照組與其他三組之間比較，其他三組腫瘤體積明顯下降p＜0.05，其中高劑量組腫瘤體積大于陽(yáng)性對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。低劑量組、高劑量組和陽(yáng)性

12、對(duì)照組腫瘤抑制率分別為31.4％、49.7％和57.7％，高劑量組腫瘤抑制率較陽(yáng)性對(duì)照低，但無(wú)顯著差異。說(shuō)明HCNO-YCS-03在體內(nèi)有顯著抗腫瘤活性，但較TPT稍弱。
　　 2.TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡低劑量組、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組與空白對(duì)照組組比較，腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯上升p＜0.05;高劑量組腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組p＜0.05。說(shuō)明HCNO-YCS-03在體內(nèi)有顯著的抗腫瘤活性，但較TPT弱。
　　 3.

13、免疫組化法檢測(cè)HIF-1α低劑量組、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組與生理鹽水組比較，HIF-1α表達(dá)明顯受到抑制p＜0.05;高劑量組對(duì)HIF-1α的抑制能力較陽(yáng)性對(duì)照組差，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果說(shuō)明HCNO-YCS-03可顯著抑制腫瘤組織HIF-1α的表達(dá)。
　　 4.血液學(xué)檢查評(píng)估藥物毒副作用低劑量組、高劑量組與空白對(duì)照組比較，荷瘤鼠的白細(xì)胞(Whitebloodcell,WBC)、紅細(xì)胞(Redbloodcell，RBC)、

14、血紅蛋白(Hemoglobin，Hb)、血小板(platelet,PLT)以及肝腎功能相關(guān)指標(biāo)（谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanineaminotransferase,ALT）、堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase,AKP)、肌酐(Creatinine，CREA)、尿素氮(Urea,UREA))均無(wú)明顯差異。陽(yáng)性對(duì)照組荷瘤鼠的WBC和PLT明顯低于其他三組p＜0.05，而肝功能相關(guān)指標(biāo)(ALT、AKP)則明顯高于其他三組p＜0.05。